大豆蚜對吡蟲啉的抗性監(jiān)測及抗性機理研究.pdf

1、大豆蚜Soybean aphid(Aphis glycines Matsumura)是大豆的重要害蟲之一，吡蟲啉自上世紀(jì)90年代推行以來，對大豆蚜良好的防治效果使其成為針對這一害蟲效果最好、使用最廣的當(dāng)家殺蟲劑，為了了解田間大豆蚜對吡蟲啉抗性的發(fā)生動態(tài)，延長吡蟲啉的田間使用壽命，本文通過田間抗性調(diào)查、室內(nèi)抗性篩選及種群適合度研究、交互抗性研究及抗性現(xiàn)實遺傳力研究，系統(tǒng)分析了大豆蚜對吡蟲啉產(chǎn)生抗性的風(fēng)險；利用室內(nèi)篩選的抗性品系和敏感品系試

2、蟲為材料，分析了抗性產(chǎn)生的生化機制；利用分子生物學(xué)技術(shù)克隆了大豆蚜煙堿型乙酰膽堿受體基因和羧酸酯酶基因，并對羧酸酯酶基因進(jìn)行了原核表達(dá)及活性分析；同時還利用熒光定量PCR技術(shù)，對大豆蚜羧酸酯酶基因mRNA水平的表達(dá)量進(jìn)行了分析，取得了多項具有理論和實際意義的重要成果。
　　 一、大豆蚜對常規(guī)殺蟲劑的敏感基線構(gòu)建和田間吡蟲啉抗性監(jiān)測
　　 通過殺蟲劑毒力測定方法建立了大豆蚜對7種常規(guī)殺蟲劑的敏感基線，并以此為基準(zhǔn)分別對20

3、10年和2011年兩年間全國大豆主要分布的5省區(qū)田間大豆蚜對吡蟲啉的抗藥性動態(tài)和哈爾濱地區(qū)田間大豆蚜對7種常規(guī)藥劑的抗藥性狀況分別進(jìn)行了監(jiān)測，結(jié)果表明，5省(區(qū))中除長春種群為低水平抗性外，其他4個省(區(qū))地理種群大豆蚜抗性為中等水平抗性，7種藥劑中，高效氯氟氰菊酯、吡蟲啉和溴氰菊酯分別產(chǎn)生高、中、低等水平的抗性，其他四種藥劑未產(chǎn)生抗藥性。
　　 二、抗吡蟲啉大豆蚜品系的選育及抗性風(fēng)險評估
　　 采用浸漬法對室內(nèi)連續(xù)飼養(yǎng)

4、多年的的大豆蚜種群進(jìn)行19代的抗性篩選，獲得了抗性倍數(shù)最高為24.46倍的室內(nèi)抗性品系。從抗性篩選的速度來看，大豆蚜對吡蟲啉的抗性發(fā)展速度并不快，與棉蚜、桃蚜的吡蟲啉抗性篩選相類似，從抗性篩選的結(jié)果來看，連續(xù)篩選的前6代抗性增長較緩慢，篩選的7到16代為快速增長期，16代后抗性基本穩(wěn)定在23倍左右，進(jìn)入了一個增長的平臺期，總體呈現(xiàn)“S”型增長趨勢。對室內(nèi)篩選19代的大豆蚜對吡蟲啉的抗性現(xiàn)實遺傳力(h2)進(jìn)行了測定，并推測出田間大豆蚜對吡

5、蟲啉的抗性提高10倍只需6～8代。這表明大豆蚜對吡蟲啉的抗性增高后，持續(xù)的抗性篩選仍能使抗藥性進(jìn)一步上升。
　　 三、吡蟲啉抗性對大豆蚜種群適合度的影響
　　 通過構(gòu)建種群生命表，觀察比較了篩選過程中吡蟲啉抗性品系T9、T18和敏感品系的一系列生長發(fā)育和繁殖特征，就抗性對種群適合度的影響進(jìn)行了研究。用內(nèi)稟增長力來確定種群的相對適合度，結(jié)果表明，抗性品系T9和T18均表現(xiàn)出相對適合度下降，而且T18的相對適合度的下降幅度明

6、顯大于T9，生長發(fā)育和繁殖上也都表現(xiàn)出一系列的不利性。
　　 四、大豆蚜抗吡蟲啉品系的交互抗性研究
　　 本研究以大豆蚜敏感品系為對照，測定了吡蟲啉抗性品系T14和T18對6種常規(guī)殺蟲劑的敏感性變化，以了解大豆蚜抗吡蟲啉品系對其他藥劑的交互抗性。結(jié)果表明，隨著大豆蚜抗性的不斷發(fā)展，抗性品系T14和T18對生產(chǎn)上常用的煙堿類殺蟲劑和菊酯類殺蟲劑均已經(jīng)產(chǎn)生不同程度的交互抗性，但未對有機磷類殺蟲劑產(chǎn)生交互抗性。
　　

7、五、大豆蚜對吡蟲啉抗性的生化機制分析
　　 通過室內(nèi)篩選獲得大豆蚜的吡蟲啉抗性品系，利用增效試驗和解毒酶活力測定，對其抗性機理進(jìn)行了研究。解毒酶活力測定表明：在抗感品系中，抗性品系的羧酸酯酶比活力明顯高于敏感品系(2.1倍)，而谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶與抗性形成無關(guān)；增效試驗結(jié)果表明：DEM在抗感品系中對吡蟲啉都沒有明顯的增效作用，而TPP和PBO在兩個品系中均有增效作用，但前者的作用更明顯。綜合分析認(rèn)為羧酸酯酶活力增強在大豆蚜對吡蟲

8、啉的抗性形成中起重要作用。
　　 六、大豆蚜煙堿型乙酰膽堿受體基因的克隆
　　 昆蟲煙堿型乙酰膽堿受體(nAChR)是以吡蟲啉為代表的新煙堿類殺蟲劑的作用靶標(biāo)位點。本研究利用RT-PCR和RACE技術(shù)，從大豆蚜中成功克隆了6個煙堿型乙酰膽堿受體基因全序列，其中5個為α亞基基因，1個為β亞基基因，分別命名為：Aglα1、Aglα2、Aglα3、Aglα4、Aglα5和Aglβ1，其中Aglα1亞基全長1456 bp，編碼4

9、27個氨基酸；Aglα2亞基全長2463 bp，編碼592個氨基酸；Aglα3亞基全長2158 bp，編碼537個氨基酸；Aglα4亞基全長1792 bp，編碼532個氨基酸；Aglα5亞基全長1850 bp，編碼549個氨基酸；Aglβ1亞基全長2406 bp，編碼509個氨基酸。其GenBank登錄號分別為JQ690271、JF775487、JQ690273、JN681173、JQ690274和JN681174。同時，還獲得了Agl

10、α1的一個選擇性剪接Aglα1-2，全長為1396 bp，編碼406個氨基酸，GenBank登錄號為JQ690272。同源性分析表明，以上亞基均具有昆蟲nAChR亞基的典型特征，與其他昆蟲nAChR亞基的同源性很高，說明克隆的基因確實是大豆蚜的nAChR基因。對大豆蚜nAChR亞基進(jìn)行多態(tài)性分析，未發(fā)現(xiàn)氨基酸突變。該研究結(jié)果為今后進(jìn)一步研究大豆蚜nAChR的天然亞基組成及功能，分析大豆蚜對新煙堿類殺蟲劑的靶標(biāo)抗性產(chǎn)生奠定了基礎(chǔ)。

11、　　 七、大豆蚜羧酸酯酶基因CarE的克隆與原核表達(dá)
　　 利用RT-PCR和RACE技術(shù)，成功克隆了大豆蚜中的羧酸酯酶基因，命名為AgCarE，全長為1946 bp，編碼526個氨基酸，GenBank登錄號為JF970181。通過序列比對和功能性分析，AgCarE具備羧酸酯酶的結(jié)構(gòu)特征，如蛋白活性中心的催化三聯(lián)體：Ser186，Glu313，His434，證明其屬于羧酸酯酶家族。通過構(gòu)建重組表達(dá)載體pET21b-AgCarE

12、進(jìn)行原核表達(dá)及Western-blot鑒定，59.2kD的目的蛋白能夠成功表達(dá)。以α-醋酸萘酯為底物的體外酶活性檢測表明，其能夠水解α-醋酸萘酯，說明表達(dá)產(chǎn)物具備羧酸酯酶活性。
　　 八、抗感大豆蚜品系羧酸酯酶mRNA表達(dá)量研究
　　 利用實時熒光定量PCR技術(shù)，以18S rDNA為內(nèi)參基因，通過比較CT值法(即2-△△Ct法)獲得了抗、感大豆蚜品系單頭蚜蟲羧酸酯酶mRNA的相對表達(dá)量。分析結(jié)果得出，抗性品系大豆蚜羧酸酯