許氏平鲉和半滑舌鰨促性腺激素釋放激素(GnRH)基因的克隆和表達(dá)分析.pdf

1、促性腺激素釋放激素(Gonadotropin-releasing hormone,CnRH),是一種十肽神經(jīng)激素,是作用于下丘腦-垂體-性腺軸的(HPG)關(guān)鍵分子。許氏平鮋(Sebastes schlegelii)有抗病力強(qiáng)、個(gè)體大、生長(zhǎng)速度快、卵胎生等優(yōu)勢(shì),已成為我國(guó)北方重要的養(yǎng)殖魚類。半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)是我國(guó)近海的一種大型名貴的海水經(jīng)濟(jì)魚種,具有生長(zhǎng)快等優(yōu)點(diǎn)。對(duì)這兩種魚類的GnRH及其受體的類型

2、、分布和作用的研究可以為闡明CnRH對(duì)HPG軸的調(diào)控機(jī)制提供一定的理論依據(jù)。
　　(1)本研究通過(guò)同源克隆和RACE(Rapid amplification of cDNA ends)技術(shù)獲得了許氏平鼬的3種以及半滑舌鰨的1種GnRH全長(zhǎng)cDNA,通過(guò)生物軟件分別對(duì)其進(jìn)行預(yù)測(cè)分析,并利用實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)對(duì)這些基因在不同組織及發(fā)育時(shí)期的時(shí)空表達(dá)進(jìn)行了研究;A.許氏平鮋GnRH-Ⅰ cDNA序列全長(zhǎng)424 bp,ORF為288 bp,

3、包括61 bp的5'UTR,36 bp和3'UTR。通過(guò)軟件預(yù)測(cè),該基因編碼了一個(gè)含有96個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)前體,分子量為10.4 kDa,在該蛋白的N末端包含一個(gè)由22個(gè)氨基酸殘基組成的信號(hào)肽。qPCR結(jié)果顯示,GnRH-I在許氏平觸雌雄成體的各9種組織中均有表達(dá),其中在全腦組織和卵巢組織中表達(dá)量最高;B.許氏平鮋GnRH-Ⅱ cDNA全長(zhǎng)615 bp,ORF為258 bp,包括146 bp的5'UJTR和184 bp的3'UTR。預(yù)測(cè)

4、其編碼86個(gè)氨基酸,分子量9.6kDa,在該蛋白的N末端包含一個(gè)由23個(gè)氨基酸殘基組成的信號(hào)肽。qPCR結(jié)果顯示,除了在性腺與全腦組織外,GnRH-Ⅱ只在許氏平鮋雌雄成體的心臟、脾、肌肉和腸中表達(dá),仍以全腦組織和卵巢組織中表達(dá)量為最高;
　　C.許氏平鮋GnRH-Ⅲ cDNA全長(zhǎng)506 bp,ORF為273 bp,包括45 bp的5'uTR和156 bp的3'uTR。預(yù)測(cè)其編碼91個(gè)氨基酸,分子量10.1 kDa,在該蛋白的N末端

5、包含一個(gè)由23個(gè)氨基酸殘基組成的信號(hào)肽。qPCR結(jié)果顯示,GnRH-Ⅲ只在許氏平鮋雌雄成體的性腺與全腦組織中表達(dá);
　　另外,利用qPCR分析發(fā)現(xiàn)許氏平觸的CnRH-Ⅰ、GnRH-Ⅱ和GnRH-Ⅲ基因在發(fā)育時(shí)期的表達(dá)均出現(xiàn)較大的波動(dòng)性。
　　D.半滑舌鰨GnRHⅢ cDNA全長(zhǎng)344 bp,ORF為276 bp,包括36 bp的5'UTR和32 bp的3'UTR。預(yù)測(cè)其編碼92個(gè)氨基酸,分子量10.3 kDa,在該蛋白的N末

6、端包含一個(gè)由23個(gè)氨基酸殘基組成的信號(hào)肽。qPCR結(jié)果顯示,CmRH-Ⅲ只在半滑舌鰨雌雄成體的性腺與全腦組織中表達(dá);發(fā)育時(shí)期半滑舌鰨GnRH-Ⅲ為母源性表述,且其胚胎孵化前后波動(dòng)較大。
　　通過(guò)軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)許氏平鮋3種GnRH以及半滑舌鰨CmRH-Ⅲ都屬于分泌型的蛋白,氨基酸序列比對(duì)分析表明以上預(yù)測(cè)出的GnRH前體氨基酸序列與其他硬骨魚類的相似性均較高,顯示出硬骨魚類的CnRH基因在進(jìn)化中的高度保守性。各組織qPCR表達(dá)分析顯示以

7、上GnRH均在與繁殖軸相關(guān)組織中的表達(dá)量較高,推測(cè)其在該物種的繁殖中有重要作用,可能參與整個(gè)繁殖過(guò)程。
　　(2)通過(guò)同源克隆和RACE技術(shù)獲得長(zhǎng)度為2359 bp的許氏平觸GnRHR-1全長(zhǎng)cDNA,包含304 bp的5'UTR、1281 bp ORF和774 bp的3'UTR,編碼426個(gè)氨基酸。結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)表明許氏平鮋GnRHR-Ⅰ含有7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域,屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族,具有典型的G蛋白偶聯(lián)受體特征:包含1個(gè)胞外N=末端尾

8、巴、3個(gè)胞外loop、3個(gè)胞內(nèi)loop、7個(gè)跨膜α螺旋以及1個(gè)胞內(nèi)C.末端尾巴。qPCR分析顯示,GnRHR-ⅠmRNA在許氏平鮋雌雄成體的全腦組織和性腺組織中均有較強(qiáng)的表達(dá),脾臟和腎臟中沒(méi)有檢測(cè)出信號(hào),在其余6個(gè)組織中表達(dá)量均較低。
　　(3)通過(guò)染色體步移法對(duì)許氏平鮋3種類型的GnRH的啟動(dòng)子區(qū)克隆并分別對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)的預(yù)測(cè)分析:GnRH1、GnRH2和GnRH3基因啟動(dòng)子區(qū)域的序列長(zhǎng)度依次約為4k bp,3.5k bp以

9、及2.5k bp。在GnRH1和GnRH3的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)TSS上游31 bp處均有1個(gè)典型的TATA box,GnRH2的。TSS上游80 bp左右有1個(gè)典型的GC box。在3個(gè)GnRH基因的啟動(dòng)子序列中,均存在Sp1、NF-1、Pit-1、C/EBP、CREB、Oct-1、GATA-1、Brn、USF和MyoD等轉(zhuǎn)錄因子,以及AR、ER、PR、GR、RAR和RXR等類固醇類核受體的結(jié)合位點(diǎn),推測(cè)其對(duì)GnRH的調(diào)控起到關(guān)鍵作用。在GnR

10、H1和GnRH2的啟動(dòng)子中還預(yù)測(cè)出TR和OIf-1結(jié)合位點(diǎn),而在GnRH3不存在,推測(cè)這些轉(zhuǎn)錄因子對(duì)這3種不同類型的GnRH基因的調(diào)控存在特異性。此結(jié)果表明不同類型的黑鮶GnRH是受不同的機(jī)制調(diào)控的,從而在生理過(guò)程中發(fā)揮著不同的作用。(4)構(gòu)建了許氏平觸GnRH-Ⅲ的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng):以pET32a為表達(dá)質(zhì)粒,將GnRH-Ⅲ cDNA序列(去掉編碼信號(hào)肽部分的序列)插入其中構(gòu)建了pET-32a/GnRH-Ⅲ重組質(zhì)粒,并在BL21(DE3