利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選與BmNPV PE38和VLF-1相互作用的蛋白.pdf

1、家蠶核型多角體病毒(Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus,BmNPV)是家蠶血液型膿病的病原,每年因該病毒感染家蠶都會(huì)對(duì)蠶業(yè)生產(chǎn)造成很大的經(jīng)濟(jì)損失。本研究通過酵母雙雜交技術(shù)構(gòu)建 BmNPV感染的雜交文庫,篩選與BmNPV核心基因Pe38、Vlf-1等互相作用的蛋白,可以更好地了解桿狀病毒與其宿主之間復(fù)雜的相互作用機(jī)制。
　　采用CLONTECH SMART(switching mechani

2、sm at5′end of RNA transcript)技術(shù),在酵母菌株Y187中構(gòu)建感染BmNPV的家蠶中腸組織的cDNA文庫。家蠶五齡第三天添食BmNPV,提取感染后12小時(shí)與96小時(shí)家蠶中腸組織的總RNA并混合均勻。進(jìn)行長距離(LD)-PCR合成雙鏈cDNA,后者經(jīng)CLONTECH CHROMA SPINTE-400柱純化后,與線性載體質(zhì)粒pGADT7-Rec共轉(zhuǎn)化入感受態(tài)酵母菌Y187中,然后在缺亮氨酸(LEU)培養(yǎng)基板上篩選

3、出所有克隆,即為感染BmNPV家蠶中腸組織的cDNA文庫。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:提取RNA的A260/A280=2.2,純度較高;雙鏈cDNA文庫大于0.2kb,且彌散較長,成瀑布條帶狀;該文庫具有基因多樣性和足夠大的庫容量,滴度為4.4×107cfu/mL,文庫擴(kuò)增后,插入cDNA的長度為750bp-2000bp,該文庫的構(gòu)建為篩選相互作用蛋白并進(jìn)一步闡明其生理意義提供了基礎(chǔ)。
　　利用酵母雙雜交技術(shù),以家蠶核型多角體病毒(BmNPV)

4、的蛋白PE38為誘餌,篩選感染BmNPV的家蠶中腸組織cDNA文庫,尋找與之相互作用的宿主蛋白及其編碼基因。將成功構(gòu)建的酵母誘餌表達(dá)載體pGBKT7-Pe38、pGBKT7-Vlf-1轉(zhuǎn)化到酵母菌Y2HGold中,并將感染BmNPV家蠶中腸組織cDNA文庫的Y187酵母細(xì)胞與含有pGBKT7-Pe38、pGBKT7-Vlf-1的酵母細(xì)胞共同培養(yǎng),篩選與PE38、VLF-1編碼蛋白相互作用的蛋白,并對(duì)陽性克隆進(jìn)行測序和生物信息學(xué)分析。未能

5、篩選出與VLF-1編碼蛋白相互作用蛋白。篩選到可能與PE38編碼蛋白有相互做用的蛋白是:家蠶轉(zhuǎn)化延伸因子2(translation elongation factor2);家蠶絲氨酸蛋白酶(Bombyx mori serine protease);過氧化氫酶(actin, muscle-type A1 catalase);膜蛋白(putative membrane protein precursor);類糜蛋白酶絲氨酸蛋白酶前體(Bom