鴨新城疫病毒核衣殼蛋白單克隆抗體的制備及應(yīng)用.pdf

1、鴨新城疫是由新城疫病毒(Newcastle Disease Virus，NDV)引起鴨的一種急性、高度接觸性、敗血性傳染病，可造成鴨的大量死亡，使養(yǎng)鴨業(yè)損失嚴(yán)重。加強(qiáng)該病的診斷方法的研究對(duì)預(yù)防和控制鴨新城疫的發(fā)生，保護(hù)和促進(jìn)養(yǎng)鴨業(yè)的健康發(fā)展具有重要意義。核衣殼蛋白(NP蛋白)是鴨新城疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白中含量最多、保守性高且具有免疫原性的一種蛋白。為此本研究構(gòu)建了NP蛋白的原核表達(dá)載體并進(jìn)行了誘導(dǎo)表達(dá)，對(duì)重組蛋白進(jìn)行了免疫原性的鑒定，并以NP

2、蛋白為免疫原，制備了NP蛋白的單克隆抗體，建立了以NP蛋白為包被抗原的間接ELISA方法，和檢測(cè)抗鴨NDV的雙抗體夾心ELISA方法。
　　 本研究根據(jù)GenBank發(fā)表的鴨NDVSDWF02株NP基因序列，設(shè)計(jì)并合成一對(duì)特異性引物，擴(kuò)增出鴨新城疫病毒的NP基因，與原核表達(dá)載體pET-28a構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET28a-NP。將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至Rosetta感受態(tài)菌種，IPTG誘導(dǎo)后，SDS-PAGE分析表明，54KD的融

3、合蛋白得以表達(dá)，主要以包含體形式存在。Western blot顯示，該蛋白能與鴨新城疫的陽(yáng)性血清發(fā)生特異性的反應(yīng)，表明具有良好的免疫原性。
　　 用純化后的重組蛋白為包被抗原，建立檢測(cè)鴨新城疫抗體的間接ELISA方法，方陣滴定試驗(yàn)確定最佳包被液為pH9.6的碳酸鹽緩沖液，最佳包被濃度為10ng/well，血清最佳稀釋度為1:1000。經(jīng)應(yīng)用試驗(yàn)表明該方法具有良好的特異性、可重復(fù)性和敏感性，為臨床檢測(cè)鴨新城疫抗體水平提供了一種簡(jiǎn)單

4、、準(zhǔn)確、快速的診斷方法。
　　 用純化的鴨NDVNP蛋白作為免疫原，免疫6-8周齡的BALB/c小鼠，通過(guò)淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，經(jīng)以重組NP蛋白為包被抗原的間接ELISA方法篩選，獲得了2株能穩(wěn)定分泌抗鴨NDVNP蛋白單抗的雜交瘤細(xì)胞株A1、B2。經(jīng)ELISA檢測(cè)A1、B2細(xì)胞上清效價(jià)均為為212，誘生的腹水的效價(jià)分別為107，106。Western blot和IFA顯示，只有A1株能與病毒發(fā)生特異性反應(yīng)?？锅哊DVNP蛋白單克隆