犬瘟熱病毒單克隆抗體的制備及其應(yīng)用.pdf

1、犬瘟熱(CD)是由犬瘟熱病毒(CDV)引起的一種高度接觸性、致死性傳染病。該病傳染性強(qiáng)、發(fā)病率和死亡率高，并可引起機(jī)體免疫抑制，已成為養(yǎng)犬業(yè)、經(jīng)濟(jì)動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)和野生動(dòng)物保護(hù)業(yè)危害最嚴(yán)重的傳染病之一。因此，建立一種快速、特異的檢測(cè)方法對(duì)該病的防控十分重要。本研究旨在制備CDV特異性單克隆抗體，建立基于單克隆抗體的CDV檢測(cè)方法，同時(shí)選擇具有中和活性的單克隆抗體制備CD單克隆抗體治療劑。試驗(yàn)內(nèi)容包括:
　　 實(shí)驗(yàn)1:犬瘟熱病毒的分離及

2、其核衣殼蛋白基因序列分析從非典型犬瘟熱(CD)病犬的肺和肝臟組織中分離犬瘟熱病毒(CDV)，用RT-PCR方法擴(kuò)增核衣殼蛋白(N)基因，進(jìn)行克隆和序列分析。結(jié)果表明:該CDV分離株N基因與已發(fā)表的12個(gè)CDV強(qiáng)毒株的核苷酸序列和氨基酸序列同源性分別在96.6％～99.2％和97.9％～99.4％之間，與已發(fā)表的4個(gè)CDV疫苗弱毒株的同源性分別在93.2％～93.6％和96.4％～97.5％之間;在N基因系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)上，該CDV分離株與

3、12個(gè)強(qiáng)毒株處在同一亞群，而且與9個(gè)中國(guó)分離毒株的親緣關(guān)系近于3個(gè)國(guó)外毒株。將N基因插入到原核表達(dá)載體pET-28a(+)構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET-N，在大腸桿菌中表達(dá)的重組N蛋白的分子量為62kDa，主要以包涵體的形式存在;用Western blotting分析，重組N蛋白可與CDV陽(yáng)性血清發(fā)生特異性反應(yīng)。
　　 實(shí)驗(yàn)2:分泌犬瘟熱病毒單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的建立用純化的犬瘟熱病毒(CDV)免疫BALB/c小鼠，制備脾細(xì)胞，與S

4、P2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，經(jīng)間接ELISA篩選和克隆化，獲得5株能穩(wěn)定分泌CDV單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為3H11、1D7、2C9、1F8和3G3，抗體亞類(lèi)分別為IgG2bκ、IgG1κ、IgG2bκ、IgG1κ和IgG1κ，誘生腹水的抗體效價(jià)分別為109、107、106、107和106。細(xì)胞染色體分析表明，5株雜交瘤細(xì)胞株染色體平均數(shù)為88～96條，高于SP2/0骨髓瘤細(xì)胞或脾細(xì)胞的染色體數(shù);間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)證明，5

5、株單抗均與CDV發(fā)生特異性反應(yīng);免疫印跡(western blotting)分析，單抗1F8和3G3能特異地識(shí)別CDV的N蛋白;在病毒中和試驗(yàn)中，單抗3H11和1D7的病毒中和效價(jià)分別為105和106，其它3株單抗則沒(méi)有中和活性;經(jīng)ELISA相加試驗(yàn)證實(shí)，5株單抗作用的抗原位點(diǎn)不同。
　　 實(shí)驗(yàn)3:犬瘟熱病毒單克隆抗體夾心ELISA檢測(cè)方法的建立用純化的犬瘟熱病毒(CDV)單克隆抗體1D7作為捕獲抗體，辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)

6、記的單克隆抗體1F8作為檢測(cè)抗體，建立檢測(cè)CDV的單克隆抗體夾心ELISA方法。優(yōu)化的試驗(yàn)反應(yīng)條件為:單克隆抗體1D7的包被濃度為2μg/mL，用10％小牛血清封閉，酶標(biāo)單克隆抗體1F8的稀釋度為1∶4000。特異性試驗(yàn)證明，單克隆抗體夾心ELISA方法與犬細(xì)小病毒(CPV)、犬副流感病毒(CPIV)、犬腺病毒1型(CAV-1)和犬冠狀病毒(CCV)無(wú)交叉反應(yīng);敏感性試驗(yàn)顯示，該方法檢測(cè)CDV病毒量的最低限為102 TCID50/mL;

7、重復(fù)性試驗(yàn)表明，夾心ELISA方法批內(nèi)、批間變異系數(shù)小于5％。該單克隆抗體夾心ELISA檢測(cè)方法具有良好的特異性、敏感性和重復(fù)性，可用于犬瘟熱病毒(CDV)的臨床檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)4:犬瘟熱病毒單克隆抗體膠體金免疫層析檢測(cè)試紙條的制備用膠體金標(biāo)記純化的單克隆抗體1F8，捕獲CDV抗原，將純化的單克隆抗體1D7和羊抗鼠IgG抗體包被于硝酸纖維素膜(NC膜)，分別作為檢測(cè)線(xiàn)和對(duì)照線(xiàn)，制備犬瘟熱病毒膠體金免疫層析檢測(cè)試紙條。優(yōu)化的試驗(yàn)反應(yīng)條件為:膠體

8、金標(biāo)記抗體的最適pH值為8.0，被標(biāo)記單克隆抗體1F8濃度為18μg/mL，包被于NC膜的抗體1D7和羊抗鼠IgG抗體的濃度分別為1.4mg/mL和2.0mg/mL。用該試紙條可特異地檢測(cè)犬瘟熱病毒，檢測(cè)CDV病毒量的最低限為103TCID50/mL，與相同單克隆抗體1D7和1F8建立的犬瘟熱病毒夾心ELISA檢測(cè)方法的敏感度相當(dāng)，在1～5min內(nèi)可得出檢測(cè)結(jié)果，試紙條簡(jiǎn)便快速，便于犬瘟熱的臨床快速診斷。
　　 實(shí)驗(yàn)5:犬瘟熱單