銀杏和葉籽銀杏microRNA的鑒定與分析.pdf

1、銀杏(Ginkgo biloba L.)系第四紀(jì)冰川之后惟一在中國保存下來的的孑遺種子植物。在其漫長的演化歷程中，銀杏的種子和葉片發(fā)生了明顯的形態(tài)變異。世界上第一株葉籽銀杏(Ginkgo biloba var.epiphylla Mak.)是由Shirai于1891年在日本發(fā)現(xiàn)的。葉籽銀杏系銀杏家族中的特異種質(zhì)，因具有明顯的葉生胚珠，而被視為觀賞佳品，同時具有重要的科研價值。雖然國內(nèi)外學(xué)者已對葉籽銀杏的分類地位和系統(tǒng)進(jìn)化進(jìn)行了研究，但對

2、于其發(fā)生機制還未有明確的定論。MicroRNAs(miRNAs)通過對靶mRNA直接切割或者抑制其翻譯，在轉(zhuǎn)錄后水平對基因表達(dá)起調(diào)控作用，其功能幾乎涉及到生長發(fā)育、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及環(huán)境響應(yīng)等生命進(jìn)程的各個方面。因此，對銀杏和葉籽銀杏開展miRNA的鑒定與功能研究具有重要的意義，為銀杏和葉籽銀杏的進(jìn)化以及葉籽銀杏產(chǎn)生葉生胚珠的分子機制研究提供了更廣闊的視角。
　　 本研究以銀杏和葉籽銀杏為試驗材料，利用高通量測序技術(shù)與生物信息學(xué)技術(shù)相

3、結(jié)合的方法，鑒定和分析了銀杏和葉籽銀杏中的miRNA。主要研究結(jié)果如下：
　　 (1)用Solexa高通量測序技術(shù)構(gòu)建了銀杏和葉籽銀杏嫩葉小RNA文庫，共獲得高質(zhì)量序列46，191，036條，其中銀杏小RNA文庫包含24，227，844條，葉籽銀杏小RNA文庫包含21，963，192條。去接頭、去污染后分別在銀杏小RNA文庫和葉籽銀杏小RNA文庫中得到23，798，499(3，059，786unique)和21，717，220(

4、2，585，993unique)條cleanreads。
　　 (2)對小RNA文庫中的cleanreads進(jìn)行分析，并進(jìn)行分類注釋。兩個文庫中小RNA長度多數(shù)都在19nt～24nt之間，長度分布峰值在21nt和24nt兩處，其中21nt處均能達(dá)到60％以上，這與小RNA的典型長度是一致的，其分布特征與其他裸子植物小RNA文庫也基本一致，而與一些被子植物的分布特征存在差異，這主要是與其加工生成的DCL酶種類不同。文庫中miRNA

5、與siRNA的含量豐富，在銀杏中分別達(dá)到12.5％和25.85％，在葉籽銀杏中分別達(dá)到13.73％和29.39％，表明在銀杏與葉籽銀杏中miRNA的調(diào)控有著重要的地位。
　　 (3)從銀杏小RNA文庫中鑒定出2，974，600條植物miRNA同源序列，其中包含20,262條uniquereads，它們隸屬于444個miRNA家族；經(jīng)過進(jìn)一步的復(fù)雜分析和嚴(yán)格篩選，共得到銀杏保守序列399，039條，這些序列隸屬24個miRNA家族

6、的69個保守miRNA成員。從葉籽銀杏小RNA文庫中鑒定出2，981，348條植物miRNA同源序列，其中包含18，685條uniquereads，隸屬于391個家族；經(jīng)篩選后得到葉籽銀杏保守序列460,037條，包含28個miRNA家族的82個保守miRNA成員。
　　 (4)在所建的銀杏及葉籽銀杏小RNA文庫中共預(yù)測到10條新miRNA候選者，其中在葉籽銀杏中預(yù)測到9條新miRNA候選者，分別為miRn1、miRn2、miR

7、n3、miRn4、miRn5、miRn6、miRn7、miRn8、miRn9、同時發(fā)現(xiàn)miRn1*；在銀杏中預(yù)測到2兩條新miRNA候選者，分別為miRn9、miRn10。這10條新miRNA候選者的前體能均形成特征性發(fā)卡環(huán)結(jié)構(gòu)，長度在20nt～23nt之間，最小折疊自由能(MFE，minimal folding free energy)都在-19.5kcal/mol以下，符合miRNA的典型特征。
　　 (5)應(yīng)用miRU算法

8、對銀杏及葉籽銀杏的miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測，在30個保守miRNA中，共預(yù)測到22個保守的miRNA家族中對應(yīng)的161個靶基因，大多數(shù)靶基因為植物轉(zhuǎn)錄因子，功能注釋顯示這些靶基因涉及到植物生長發(fā)育和環(huán)境響應(yīng)的各個方面；在10個新miRNA中共發(fā)現(xiàn)37個靶基因，這些靶基因中有17個編碼功能蛋白，還有20個編碼未知功能的蛋白。
　　 (6)對銀杏和葉籽銀杏中miRNA的表達(dá)量進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，MIR156、MIR164、MIR168、M

9、IR169、MIR390、MIR397、MIR399、MIR408、MIR535、MIR1030在葉籽銀杏中的表達(dá)量要比在銀杏中的高，且差異極顯著；MIR159、MIR160、MIR394、MIR828在銀杏中的表達(dá)量要比葉籽銀杏中高，且差異極顯著。
　　 本研究通過對銀杏及葉籽銀杏miRNA的鑒定與分析，發(fā)現(xiàn)在銀杏及葉籽銀杏中存在數(shù)量眾多的小RNA，這預(yù)示著銀杏及葉籽銀杏中可能存著復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控機制。銀杏與葉籽銀杏m