小鵝瘟病毒VP3基因的克隆表達(dá)及抗小鵝瘟病毒單克隆抗體的研制.pdf

1、鵝細(xì)小病毒感染(GooseParvovirusInfection)，又稱為小鵝瘟(Goslingplaque)，是由鵝細(xì)小病毒(Gooseparvovirus，GPV)引起的一種急性、高度接觸性、敗血性傳染病。主要侵害30日齡以內(nèi)雛鵝和雛番鴨，以滲出性腸炎、心、肝、腎等實(shí)質(zhì)器官炎癥為特征，致病性強(qiáng)，死亡率高，是目前危害養(yǎng)鵝業(yè)的主要疾病之一。本研究對(duì)GPV疫苗株SYG61和流行株P(guān).1的VP3基因進(jìn)行了克隆測序及序列比較分析，進(jìn)而對(duì)兩者的

2、部分生物學(xué)特性進(jìn)行了比較研究，并應(yīng)用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)對(duì)GPV疫苗株SYG61的VP3基因進(jìn)行了表達(dá);利用GPVSYG61免疫BalB/c小鼠，制備了2株抗GPV的單克隆抗體，為GPV的檢測和防治提供了優(yōu)良的生物學(xué)材料。
　　 1.小鵝瘟病毒VP3基因的克隆與表達(dá)
　　 本研究對(duì)GPV疫苗株SYG61和流行株P(guān).1的VP3基因進(jìn)行克隆測序及序列比較分析，測序結(jié)果表明，兩株不同GPV毒株的VP3基因核苷酸序列長均為1605b

3、p，編碼534個(gè)氨基酸。序列對(duì)比結(jié)果顯示，兩株不同GPV毒株的VP3基因核苷酸同源性為95.8％，氨基酸同源性為98.1％。與GenBank上發(fā)表的國內(nèi)外其他GPV毒株的核苷酸同源性為93.6％-99.9％，氨基酸同源性為96.3％～99.8％。雖然GPV疫苗株SYG61和流行株P(guān).1的VP3基因同源性較高，但從進(jìn)化樹分析來看，仍表現(xiàn)出一定的地區(qū)差異性。ELD50和LD50的測定結(jié)果為GPVP.1株對(duì)鵝胚的半數(shù)致死量(ELD50)為10

4、-5.29/0.2mL，對(duì)雛鵝的半數(shù)致死量(LD50)為10233/0.2mL;GPVSYG61株對(duì)鵝胚的半數(shù)致死量(ELD50)為10-6.0/0.2mL，對(duì)雛鵝的半數(shù)致死量(LD50)為10-3.45/0.2mL。表明兩株GPV毒株毒力、致病力沒有明顯差異。利用雛鵝制備的抗GPVSYG61株和P.1株的免疫血清，通過鵝胚中和試驗(yàn)測定了兩株不同GPV株抗血清的PD50，并通過血清交叉保護(hù)試驗(yàn)對(duì)兩株不同GPV株的抗原性進(jìn)行比較，經(jīng)過計(jì)算

5、后得出兩者抗原性相關(guān)系數(shù)R為85.41％，表明這兩株GPV毒株之間存在血清交叉反應(yīng)，且抗原性交叉較大，屬于同一血清型。
　　 應(yīng)用Bac-to-Bac系統(tǒng)對(duì)GPV毒株SYG61VP3基因進(jìn)行了表達(dá)。首先利用BamHI和XhoI雙酶切將VP3基因片段從pGEM-T-VP3重組載體中切下，連接至桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFastBacl中，獲得重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFastBacl-VP3，并轉(zhuǎn)座含有桿狀病毒穿梭質(zhì)粒的大腸桿菌DH10Bac感受態(tài)細(xì)

6、胞，篩選出重組穿梭質(zhì)粒rBacmid-VP3，轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞，獲得了重組桿狀病毒rBac-VP3。根據(jù)桿狀病毒載體序列，經(jīng)過PCR鑒定，證實(shí)基因片段VP3已經(jīng)重組到桿狀病毒基因組中;用抗GPV多抗血清進(jìn)行間接免疫熒光檢測，結(jié)果出現(xiàn)亮綠色熒光，證明VP3基因獲到了良好表達(dá)。
　　 2.抗GPV單克隆抗體的制備與鑒定
　　 本研究利用GPVSYG61作為抗原免疫BalB/c小鼠。免疫三次后取其脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞進(jìn)行融

7、合，通過間接免疫熒光檢測雜交瘤細(xì)胞上清，篩選獲得了2株抗GPV的單克隆抗體，分別命名為GPV-Mab-2C5，GPV-Mab-4G9。亞類鑒定結(jié)果表明，2株單抗均為IgM亞類。2C5單抗腹水和細(xì)胞上清的IFA效價(jià)分別為1:3200和1:800，4G9單抗腹水和細(xì)胞上清的IFA效價(jià)分別為1:256和1:64。瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)證明2株單抗腹水都能與濃縮的小鵝瘟抗原產(chǎn)生明顯的沉淀線。并且均能與桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的GPVVP3蛋白反應(yīng)，產(chǎn)生特異性