家蠶感染白僵菌差異表達(dá)基因研究.pdf

1、球孢白僵菌(Beauveria bassian)是蠶業(yè)生產(chǎn)上危害最嚴(yán)重的病原真菌,其導(dǎo)致的僵病是養(yǎng)蠶業(yè)的三大傳染病之一,給蠶業(yè)生產(chǎn)帶來了重大的經(jīng)濟(jì)損失。開展家蠶與白僵菌互作的分子機(jī)制研究,對(duì)探索昆蟲宿主與病原真菌的應(yīng)答、對(duì)僵病的診斷防治、及將其運(yùn)用到農(nóng)林害蟲的生物防治、提高其殺蟲效果具有重要意義。
　　以家蠶P50為實(shí)驗(yàn)品種(本研究所用的蠶品種均是P50),白僵菌體表接觸感染家蠶幼蟲的體壁及附著組織為實(shí)驗(yàn)組、水處理家蠶幼蟲的體壁及

2、附著組織為對(duì)照材料,利用抑制性消減雜交方法構(gòu)建了正反向消減cDNA文庫,240個(gè)陽性克隆經(jīng)測(cè)序、比對(duì)分析共獲得56個(gè)已知基因和32個(gè)新的ESTs序列。Real-time quantity PCR分析了其中的6個(gè)基因(熱激蛋白70,親環(huán)素,翻譯控制腫瘤蛋白,乙醇還原酶,過氧化氫酶,核糖體膜相關(guān)的蛋白4)分別在感染后6h、8h、10h、12h、15h、18h、24h時(shí)感染蠶與對(duì)照蠶體壁及附著組織的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平。
　　以家蠶5齡第三天的

3、幼蟲為試驗(yàn)對(duì)象,以體壁穿刺感染白僵菌的蠶為實(shí)驗(yàn)組、穿刺滅菌水的蠶為對(duì)照組,采用抑制性消減雜交方法構(gòu)建了感染蠶和對(duì)照蠶血淋巴與體壁及附著組織的正、反向文庫,140個(gè)陽性克隆測(cè)序分析后共得到48個(gè)已知基因和5個(gè)未知ESTs序列。與體壁接觸感染的數(shù)據(jù)庫相比較,本庫中與蛋白質(zhì)合成、運(yùn)輸、貯存功能有關(guān)的基因出現(xiàn)的頻率比較高;與免疫有關(guān)的應(yīng)激基因的種類有一定的差異,除了都有的熱激蛋白類、過氧化氫酶、抗菌肽B前體外,體壁庫中還有泛素、核糖體蛋白L10

4、A、乙醇脫氫酶、細(xì)胞色素b等,而穿刺庫有溶菌酶、rubisco活化酶、Moricin、gloverin4等。Real-time quantity PCR分析了其中的6個(gè)基因(轉(zhuǎn)鐵蛋白、化學(xué)感應(yīng)蛋白11、肌肉LIM蛋白亞型、性別特異性貯存蛋白SP1、芳基貯存蛋白、30KD脂蛋白)在穿刺后3h、6h、9h、12h、24h時(shí)感染血淋巴與對(duì)照血淋巴中的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平。
　　用RACE方法從體表感染的正向庫中克隆了編碼家蠶鋅指蛋白1的基因(B

5、mZF1)和編碼高遷移率族蛋白(BmHMBG)基因的全長(zhǎng)cDNA,并對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。BmZF1基因的cDNA全長(zhǎng)是1850 bp,其中5’非翻譯區(qū)有195 bp、3’非翻譯區(qū)有464bp,1191 bp的開放閱讀框,共編碼396個(gè)氨基酸;在多肽鏈的第4-28、66-90、172-195、223-250的氨基酸殘基處各含有一個(gè)ZnF-C2H2結(jié)構(gòu)域,該基因編碼的蛋白屬于C2H2型鋅指蛋白,是鋅指蛋白家族中的一員。BmHMBG基因

6、的全長(zhǎng)為3015 bp,含313 bp的5’非翻譯區(qū)和2114 bp的3’非翻譯區(qū),588bp的開放閱讀框,共編碼195個(gè)氨基酸。這是一個(gè)小分子親水蛋白,在多肽鏈的第107-173氨基酸殘基上含有一個(gè)HMGB-UBF_HMG-box結(jié)構(gòu)域,這是一種DNA結(jié)合蛋白,屬HMG-Box超家族。
　　BmZF1和BmHMBG在家蠶的脂肪體、血淋巴、體壁、中部絲腺、后部絲腺、中腸、馬氏管、生殖腺等主要組織中均有表達(dá);Real-time qu

7、antity PCR結(jié)果表明,BmZF1在感染組織中的表達(dá)水平明顯上調(diào),可能是發(fā)揮了其通用轉(zhuǎn)錄因子的作用,使感染組織中其他蛋白的表達(dá)也上調(diào),使機(jī)體無法利用凋亡等途徑抑殺吞噬了白僵菌菌絲的細(xì)胞,從而使有免疫功能的血細(xì)胞數(shù)量逐漸減少,真菌孢子的數(shù)量逐步增加。BmHMGB熒光定量PCR結(jié)果表明,在感染白僵菌的家蠶組織中的表達(dá)水平明顯高于正常組織,以感染后24h的相對(duì)表達(dá)量為例:感染白僵菌的后部絲腺是對(duì)照后部絲腺的5.98倍,中部絲腺是7.31

8、倍,中腸10.31倍,性腺4.56倍,馬氏管4.20倍,脂肪體6.11倍,體壁8.34倍,血淋巴21.71倍。推測(cè)當(dāng)白僵菌侵染家蠶后,宿主的天然免疫應(yīng)答被激活,家蠶具有免疫功能的血細(xì)胞主動(dòng)分泌、凋亡的細(xì)胞被動(dòng)釋放BmHMGB,最終體液中BmHMGB的濃度升高,BmHMGB與其他因素的協(xié)調(diào)作用導(dǎo)致家蠶機(jī)體功能紊亂,最終死亡。
　　本研究為從分子水平上闡明家蠶應(yīng)對(duì)白僵菌侵染的應(yīng)答機(jī)制和白僵菌感染家蠶的致病機(jī)理提供了新視野和新依據(jù),為進(jìn)