大蒜病毒的分子檢測及脫毒技術(shù)的研究.pdf

1、大蒜（AlliumsativumL.）為百合科蔥屬植物，自然條件下的大蒜一般受到兩種或兩種以上病毒的侵染。大蒜是無性生殖作物，在生產(chǎn)上一般采取留種栽培，因此病毒在大蒜植物體內(nèi)逐代累積，嚴重影響了大蒜的產(chǎn)量和質(zhì)量。目前侵染大蒜的病毒主要有香石竹潛隱病毒屬、馬鈴薯Y病毒屬和青蔥X病毒屬成員等。對于植物病毒的鑒定，使用得比較廣泛的有電子顯微鏡鑒定法，血清學(xué)法和分子生物學(xué)法，其中最靈敏、特異性最強的是分子生物學(xué)法，本實驗采取的是RT-PCR法，

2、是從核酸的層面上來檢測大蒜病毒。本實驗的主要研究有：
　　1.首先大致調(diào)查國內(nèi)大蒜病毒病的發(fā)生情況，本實驗收集了四個大蒜主要產(chǎn)區(qū)的樣品進行實驗，他們分別來自于貴州、四川、陜西、重慶。首先是采用傳統(tǒng)RT-PCR法檢測病毒，通過提取大蒜的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，根據(jù)已發(fā)表的大蒜3'端保守序列設(shè)計引物進行PCR擴增，獲得的目的片段連接載體后導(dǎo)入到大腸桿菌中克隆，提取質(zhì)粒酶切后送往上海生工測序，序列結(jié)果與GenBank中收錄的序列分

3、析比對后得知從大蒜樣品上分離到的病毒是香石竹潛隱病毒屬的大蒜潛隱病毒、馬鈴薯Y型病毒和大蒜新型病毒。
　　2.對擴增出的目的片段作單鏈多態(tài)性分析，本實驗采用聚丙烯酰胺凝膠電泳法進行分析，PAGE能精確的檢測出相同長度的DNA一個堿基上發(fā)生的變化。4個樣品的PCR產(chǎn)物熱變性處理后使其雙鏈DNA解螺旋變?yōu)閱捂?，?jīng)PAGE電泳后均只出現(xiàn)了兩條主帶，分別是兩條單鏈DNA，說明不同樣品中的同一病毒之間不存在差異，也未有突變發(fā)生。
　　

4、3.在傳統(tǒng)RT-PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上，對實驗進行了改良和優(yōu)化，改良了RNA的提取方法大大縮短了實驗時間；優(yōu)化了PCR反應(yīng)過程，增加了循環(huán)次數(shù)，并嘗試了一步法兩步法等，尋找最適宜的擴增條件，最終建立起一套快速檢測大蒜病毒的方法，在保證了相同靈敏度和特異性的同時縮短了檢測時間。
　　4.目前防治大蒜的病毒病最有效的方式是培育和推廣使用無毒苗，實驗采用了高溫脫毒法和藥物脫毒法處理大蒜的根尖，將脫毒厚的根尖經(jīng)組織培養(yǎng)再生誘導(dǎo)成新的植株，最終