水稻與水稻黑條矮縮病毒p5b互作基因的篩選.pdf

1、水稻黑條矮縮病毒(RBSDV)屬于呼腸孤病毒科（Reoviridae）斐濟(jì)病毒屬（Figivirus）。感染RBSDV的水稻植株表現(xiàn)出明顯的癥狀，包括植株矮縮、分蘗增多、葉色濃綠、沿莖和葉脈出現(xiàn)瘤狀突起等。該病毒基因組由10條dsRNA組成，根據(jù)其在聚丙烯酰胺凝膠上的遷移率依次命名為S1-S10。第5條基因序列(S5)包括兩個(gè)開(kāi)放閱讀框(ORF)，編碼兩個(gè)蛋白（p5a和p5b）。已有研究表明p5b是一個(gè)非結(jié)構(gòu)病毒蛋白，大小約為26.5

2、kDa，但其功能尚不清楚。根據(jù)基因序列比對(duì)分析及其表達(dá)模式推測(cè)p5b可能與病毒的致病性及其在植物體內(nèi)的增殖過(guò)程相關(guān)。
　　 為了研究p5b的功能，我們先擴(kuò)增獲得p5b基因并將其連接到質(zhì)粒pGBKT7誘餌載體上，將重組質(zhì)粒命名為pGBKT7-p5b，然后將其轉(zhuǎn)化到酵母Y2H Gold菌株中。Western blotting檢測(cè)表明p5b蛋白可以在酵母菌株中有效表達(dá)，并且p5b蛋白在酵母中不存在毒性和自激活活性。同時(shí)，我們利用pGA

3、DT7-DEST載體與Gateway技術(shù)構(gòu)建了水稻cDNA表達(dá)文庫(kù)。用轉(zhuǎn)有pGBKT7-p5b的酵母Y2H GOLD菌株與含有水稻cDNA文庫(kù)質(zhì)粒的酵母Y187菌株進(jìn)行Mating試驗(yàn)，Mating產(chǎn)物涂布在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp和SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal培養(yǎng)基平板上，篩選與p5b互作的水稻基因。將篩選到的克隆擴(kuò)大培養(yǎng)后抽提質(zhì)粒并測(cè)序，經(jīng)過(guò)序列分析和驗(yàn)證后，共篩選到8個(gè)在酵母中與

4、p5b互作的水稻基因。通過(guò)雙分子熒光互補(bǔ)試驗(yàn)證實(shí)p5b與其中一個(gè)寄主因子（核糖核酸酶）在植物體內(nèi)存在互作。序列分析顯示這些篩選到的寄主因子是參與植物光合作用、呼吸作用和其他一些重要代謝途徑的關(guān)鍵酶，暗示這些蛋白互作可能與病株癥狀的產(chǎn)生發(fā)展有關(guān)。
　　 此外，本研究還進(jìn)一步應(yīng)用不同的方法分析了p5b在植物和昆蟲(chóng)細(xì)胞中的定位。利用煙草瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)研究發(fā)現(xiàn)，p5b-GFP融合蛋白在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均有分布。在Bac-to-Bac昆蟲(chóng)桿