家蠶感染質(zhì)型多角體病毒相關(guān)基因的克隆、表達(dá)及功能分析.pdf

1、病毒感染是造成家蠶死亡的主要原因,對養(yǎng)蠶業(yè)造成的損失約占全部蠶病損失的70％左右,其中,家蠶質(zhì)型多角體病毒是引起家蠶病毒病的重要病原體之一。昆蟲的抗病毒機(jī)制研究仍處于起始階段,對家蠶中利用細(xì)胞凋亡進(jìn)行抗病毒以及由此產(chǎn)生的免疫抑制機(jī)制還不是很清楚。本論文采用RACE、RT-PCR和基因原核重組表達(dá)等分子生物學(xué)技術(shù)開展了對家蠶神經(jīng)節(jié)苷酯誘導(dǎo)分化相關(guān)蛋白1(BmGDAP1)、胰島素相關(guān)肽結(jié)合蛋白(BmIBP2)、含有LIM和SH3結(jié)構(gòu)域的蛋白

2、(BmLASP1)、泛素蛋白連接酶E3樣Synoviolin(BmSYVN)、肽聚糖識別蛋白(BmPGRP)、芳香貯存蛋白(BmAryl)、泛素羧基端水解酶46(BmUSP46)、依賴ATP的RNA解旋酶DDX54(BmDDX54)等基因進(jìn)行了克隆、表達(dá)和功能研究。
　　BmGDAP1、BmIBP2、BmLASP1、BmSYVN基因是與家蠶細(xì)胞凋亡相關(guān)的一些基因,它們的cDNA全長分別為1514、1179、2094、和1739 b

3、p,開放閱讀框編碼的蛋白分別含有332、260、455和450個(gè)氨基酸殘基。這些蛋白均含有保守的結(jié)構(gòu)域,并分別具有各蛋白家族保守的序列特征。BmGDAP1中包含一個(gè)thioredoxin(TRX)、一個(gè)glutathione S-transferase-C(GST-C)和一個(gè)C端的穿膜結(jié)構(gòu)域;BmIBP2包含一個(gè)信號肽、IG和IGc2結(jié)構(gòu)域;BmLASP1包含一個(gè)LIM、兩個(gè)nbulin和一個(gè)SH3結(jié)構(gòu)域;BmSYVN包含一個(gè)HRD1結(jié)

4、構(gòu)域。
　　對BmGDAP1、BmIBP2、BmLASP1、BmSYVN的mRNA的組織表達(dá)特異性和對感染BmCPV的響應(yīng)進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)在健康的五齡第3天的家蠶中,BmIBP2僅在中腸中表達(dá),而其它基因在各個(gè)檢測組織中均有表達(dá)。BmGDAP1在血淋巴和中腸的表達(dá)量較高, BmLASP1在精巢、卵巢、血淋巴和氣管中表達(dá)量較高,其中性腺中的表達(dá)量最高。對家蠶個(gè)體進(jìn)行病毒接種后可顯著誘導(dǎo)BmIBP2在中腸中的表達(dá),BmGDAP1和Bm

5、SYVN在中腸中的表達(dá)量也被上調(diào);而中腸中的BmLASP1的表達(dá)被抑制,其表達(dá)量下調(diào)。推測這些分子可能參與了家蠶對病毒感染誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的免疫防御調(diào)節(jié)。
　　家蠶感染BmCPV后其他一些差異表達(dá)的基因-BmPGRP、BmAryl、BmUSP46、BmDDX54,它們的cDNA全長分別為807、2260、1440、和1954 bp,開放閱讀框編碼的蛋白分別含有200、696、392和605個(gè)氨基酸殘基,且這些蛋白均含有保守的結(jié)構(gòu)域,并

6、分別具有各蛋白家族保守的序列特征。BmPGRP中包含一個(gè)信號肽和PGRP結(jié)構(gòu)域;BmAryl包含一個(gè)信號肽、一個(gè)Hemocyanin-N、Hemocyanin-M和Hemocyanin-C結(jié)構(gòu)域;BmUSP46包含一個(gè)peptidase-C19結(jié)構(gòu)域;BmDDX54包含一個(gè)DEADc、HELICc和DBP10C結(jié)構(gòu)域。
　　對BmPGRP、BmAryl、BmUSP46、BmDDX54的mRNA的組織表達(dá)特異性和對感染BmCPV的響

7、應(yīng)進(jìn)行了研究。發(fā)現(xiàn)在健康的五齡第三天的家蠶中,這些基因在各個(gè)檢測組織中均有表達(dá),除了BmAryl在脂肪體和血淋巴的表達(dá)量很高,其他基因在各個(gè)組織中的表達(dá)量差別不大。對家蠶個(gè)體進(jìn)行病毒接種后可顯著抑制BmAryl在中腸中的表達(dá), BmUSP46略有下調(diào),而BmPGRP和BmDDX54在中腸中的表達(dá)量上調(diào)。推測這些分子可能通過不同的途徑參與家蠶對病毒感染的免疫防御調(diào)節(jié)。
　　通過構(gòu)建原核表達(dá)載體對BmIBP2和BmPGRP的成熟肽進(jìn)行

8、體外重組表達(dá),純化并得到了該重組表達(dá)蛋白,western檢測證明了重組表達(dá)的正確性。通過制備多克隆抗體,檢測到BmIBP2蛋白主要在家蠶中腸中表達(dá),與其mRNA的表達(dá)特異性是一致的,推測BmIBP2通過自分泌或旁分泌起作用。
　　除了在基因的mRNA水平上,我們還在蛋白水平上檢測了家蠶感染BmCPV后表達(dá)差異的蛋白。通過蛋白質(zhì)雙向電泳對感染蠶和對照組的中腸組織蛋白進(jìn)行了比較分析,找到了8個(gè)差異蛋白點(diǎn),進(jìn)一步利用質(zhì)譜技術(shù)對這些差異點(diǎn)

9、進(jìn)行鑒定,其中在感染蠶中腸上調(diào)表達(dá)的蛋白點(diǎn)有5個(gè),經(jīng)質(zhì)譜鑒定分別為Ras-鳥嘌呤核苷酸釋放因子1
　　(RASGRF1)、H+轉(zhuǎn)運(yùn)ATP合成酶亞基、異戊烯磷酸合酶亞基2(PDSS2)、多藥耐藥蛋白(MRP4/ABCC4)和凍壞B樣蛋白(NIPBL);在對照蠶中出現(xiàn)的蛋白點(diǎn),而在感染蠶下調(diào)的有3個(gè),經(jīng)質(zhì)譜鑒定分別為類固醇脫氫酶、線粒體的電壓依賴的陰離子通道孔蛋白和一個(gè)未知蛋白。
　　本研究結(jié)果表明,差異基因BmGDAP1、Bm