草酸氧化酶基因轉(zhuǎn)化楊樹的研究.pdf

1、　　草酸作為真菌分泌的毒素并參與致病，目前已在核盤菌屬等10個(gè)屬中有報(bào)道。利用草酸降解酶的轉(zhuǎn)基因植物來獲得對(duì)分泌草酸病原真菌的抗性是一個(gè)極具前途的方法。而且，分解草酸所產(chǎn)生的H2O2對(duì)病菌侵襲的早期反應(yīng)，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中調(diào)節(jié)過敏性壞死反應(yīng)以及激活植物防御基因表達(dá)等抗病反應(yīng)過程中都發(fā)揮著重要作用。　　本研究利用根癌土壤桿菌介導(dǎo)的葉盤法將來自小麥的草酸氧化酶基因(OxO)轉(zhuǎn)入優(yōu)良楊樹樹種，以獲得對(duì)多種病原真菌有“廣譜抗性”的轉(zhuǎn)基因楊樹。所用

2、工程菌為LBA4404，雙元植物表達(dá)載體為OxO-pGPTV-KAN，其上含有OxO基因gf2.8，卡那霉素(Kan)抗性標(biāo)記基因。選用抗逆性較強(qiáng)、廣為種植的84K楊和三倍體毛白楊作受體材料。具體研究?jī)?nèi)容如下：　　1.建立了84K楊葉盤外植體高效再生系統(tǒng)。首次將2,4-D同時(shí)用于楊樹組織培養(yǎng)中的愈傷組織誘導(dǎo)和芽分化，篩選出最佳84K楊葉盤外植體最佳不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為：MS+0.02mg/L2,4-D+1.0～1.5mg/L6-BA

3、；葉盤誘導(dǎo)率高達(dá)90﹪～100﹪；每葉平均誘導(dǎo)芽數(shù)多達(dá)20個(gè)左右。　　2.通過腋芽分化獲得三倍體毛白楊無菌苗，并建立了三倍體無菌苗的擴(kuò)繁體系。篩選出適宜三倍體毛白楊葉盤不定芽分化的培養(yǎng)基為1/2MS+0.75mg/L6-BA+0.01mg/LNAA+20g/L蔗糖；葉盤誘導(dǎo)率為60﹪左右；每葉平均誘導(dǎo)芽數(shù)為3～4個(gè)左右。　　3.進(jìn)行了84K楊和三倍體毛白楊的卡那霉素敏感性測(cè)定。確定了84K楊和三倍體毛白楊葉片芽誘導(dǎo)卡那霉素臨界篩選濃

4、度分別為20mg/L和15mg/L；并確定了兩者芽生根卡那霉素臨界篩選濃度分別為20mg/L和15mg/L?！　?.摸索了根癌土壤桿菌介導(dǎo)的葉盤法轉(zhuǎn)化楊樹的各種影響因素?；敬_定適宜的轉(zhuǎn)化路線為：誘導(dǎo)培養(yǎng)基上葉盤預(yù)培養(yǎng)2～3d→OD600約為0.5稀釋的菌液中侵染5～10min→誘導(dǎo)培養(yǎng)基上共培養(yǎng)4～5d(暗培養(yǎng))→脫菌處理10d左右(誘導(dǎo)培養(yǎng)基附加適量濃度的頭孢霉素或羧芐青霉素)→選擇性生根培養(yǎng)基上篩選獲得抗卡那霉素再生苗(大約需要