甜菜M14品系BvM14-glyoxalaseⅠ基因的克隆與功能分析.pdf

1、甜菜M14品系是在栽培甜菜（BetavulgarisL.）染色體組上附加野生白花甜菜（B．corollifloraZoss.）第9號染色體的甜菜單體附加系。經(jīng)鑒定甜菜M14品系具有野生白花甜菜的一些優(yōu)良性狀，如抗旱性、耐鹽性、抗寒性以及無融合生殖等，課題組推測甜菜M14品系展現(xiàn)的優(yōu)良性狀可能與白花甜菜第9號染色體的導(dǎo)入有關(guān)，因此甜菜M14品系是挖掘和利用甜菜優(yōu)質(zhì)基因，促進(jìn)栽培甜菜育種改良的良好材料。
　　 前期工作基礎(chǔ)中，課題組

2、以栽培甜菜為對照，對甜菜M14品系花器官進(jìn)行了比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究，共獲得差異蛋白質(zhì)點(diǎn)71個，乙二醛酶Ⅰ是其中之一。甜菜M14品系鹽脅迫下的比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，乙二醛酶Ⅰ蛋白在葉片中受鹽脅迫上調(diào)表達(dá)（2倍），說明乙二醛酶Ⅰ可能參與甜菜M14品系的抗鹽過程。本試驗是對甜菜M14品系乙二醛酶Ⅰ基因功能的深入研究。
　　 乙二醛酶Ⅰ與能量代謝密切相關(guān)，廣泛存在于動物、植物和微生物中。在輔因子還原型谷胱甘肽(GSH)的協(xié)助下，乙二醛酶

3、Ⅰ將丙酮醛(methylglyoxal，MG)轉(zhuǎn)化為S-D-乳酰谷胱甘肽，乙二醛酶Ⅱ以其為底物，最終轉(zhuǎn)化為D-乳糖，從而降低MG含量，解除MG對細(xì)胞的毒害損傷。除此之外，乙二醛酶Ⅰ還參與調(diào)控細(xì)胞的分裂和增殖、微管組裝、囊泡的活化等過程，與細(xì)胞的有絲分裂過程密切相關(guān)。近年來，研究發(fā)現(xiàn)乙二醛酶Ⅰ廣泛參與植物非生物脅迫的應(yīng)答反應(yīng)，同時還對病菌侵染植物組織產(chǎn)生應(yīng)答現(xiàn)象，說明植物乙二醛酶Ⅰ在作物改良及植物抗逆機(jī)制研究中具有潛在的應(yīng)用價值。

4、　　 本試驗基于課題組的前期工作基礎(chǔ)，利用電子克隆及RACE技術(shù)獲得甜菜M14品系乙二醛酶Ⅰ基因(BvM14-glyoxalaseⅠ)cDNA全長，共計1449bp，包含1065bp的最大ORF，編碼354aa;序列分析顯示，該蛋白質(zhì)含有兩個乙二醛酶結(jié)構(gòu)域及多個谷胱甘肽、金屬離子結(jié)合位點(diǎn)：半定量RT-PCR分析結(jié)果顯示BvM14-glyoxalaseⅠ基因在甜菜M14品系根、莖、葉、花中廣泛表達(dá)，且在花中表達(dá)量最高；該基因能夠應(yīng)答高鹽

5、、干旱、氧化脅迫，并在根和葉中參與不同的應(yīng)答機(jī)制。
　　 構(gòu)建了BvM14-glyoxalaseⅠ基因的大腸桿菌表達(dá)體系，在0.5mmol/LIPTG、37℃的誘導(dǎo)條件下BvM14-glyoxalaseⅠ蛋白表達(dá)量最大，并主要以包涵體的形式存在；Western印跡結(jié)果呈陽性，說明BvM14-glyoxalaseⅠ融合蛋白在大腸桿菌BL21(DE3)中能夠正確表達(dá)。以轉(zhuǎn)空質(zhì)粒菌株為對照，對轉(zhuǎn)BvM14-glyoxalaseⅠ基因的

6、大腸桿菌BL21(DE3)菌體在MG脅迫下的生長曲線進(jìn)行了測定，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因菌株比對照菌株提前1h進(jìn)入生長期，說明BvM14-glyoxalaseⅠ基因能夠緩解MG對大腸桿菌生長的抑制。
　　 構(gòu)建BvM14-glyoxalaseⅠ基因植物表達(dá)載體，并在煙草中穩(wěn)定表達(dá)。通過基因組PCR及RT-PCR篩選陽性植株；酶活測定結(jié)果顯示，T0代轉(zhuǎn)基因植株G2和G3葉片中g(shù)lyoxalaseⅠ酶活力分別是對照野生型煙草WT的2.2倍和1

7、.5倍，說明BvM14-glyoxalaseⅠ基因在轉(zhuǎn)基因煙草中成功表達(dá)。葉盤抗性試驗結(jié)果顯示，在不同濃度的MG、NaC1、甘露醇及H2O2脅迫下轉(zhuǎn)基因煙草G2葉片的褪綠速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于WT葉盤。以WT幼苗為對照，對T1代轉(zhuǎn)基因煙草幼苗line2進(jìn)行上述脅迫處理，結(jié)果顯示line2幼苗生長狀況、鮮重、根長、葉片褪綠情況均好于WT幼苗。以上結(jié)果證實甜菜M14品系BvM14-glyoxalaseⅠ基因的過量表達(dá)能夠提高煙草對MG、高鹽、干旱及氧