小黑楊bHLH轉(zhuǎn)錄因子基因的克隆及遺傳轉(zhuǎn)化.pdf

1、本研究以小黑楊為實(shí)驗(yàn)材料，對(duì)小黑楊中2個(gè)bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族的基因以及啟動(dòng)子進(jìn)行了克隆，并分別命名為PxbHLH01和PxbHLH02。并對(duì)獲得的基因編碼區(qū)核苷酸序列，推定的氨基酸序列以及編碼蛋白，和獲得的啟動(dòng)子區(qū)序列進(jìn)行了詳細(xì)的生物信息學(xué)分析。并構(gòu)建了pBI121-PxbHLH01/PxbHLH02植物表達(dá)載體，通過(guò)根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)，成功轉(zhuǎn)化小黑楊葉片，并獲得轉(zhuǎn)基因小黑楊植株。最后，根據(jù)PxbHLH01和PxbHLH02兩

2、個(gè)基因的啟動(dòng)子區(qū)序列，構(gòu)建了含有PxbHLH01和PxbHLH02啟動(dòng)子部分片段序列的pAbAi-PxbHLH01/PxbHLH02酵母單雜交誘餌載體。為進(jìn)一步研究PxbHLH01和PxbHLH02基因的上游調(diào)控表達(dá)機(jī)制奠定基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:
　　1、小黑楊PxbHLH01和PxbHLH02基因編碼區(qū)全長(zhǎng)的克隆及生物信息學(xué)分析
　　本研究獲得了PxbHLH01和PxbHLH02基因編碼區(qū)序列全長(zhǎng)，分別為411bp和41

3、7bp，已上傳至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，登錄號(hào)分別為KJ466370和KJ466371。經(jīng)過(guò)NCBI比對(duì)，與擬南芥UPBEAT1、bHLH151基因核苷酸序列(AT2G47270.1)的一致性分別為38.85％和40.71％;與毛果楊未知功能基因核苷酸序列(XM_002320932.1)的一致性分別為97.57％和82.73％;與毛果楊未知功能基因核苷酸序列(XM_002301486.1)的一致性分別為82.38％和98.32％。

4、　　通過(guò)生物軟件對(duì)PxbHLH01和PxbHLH02推定氨基酸序列進(jìn)行了預(yù)測(cè)和生物信息學(xué)分析。構(gòu)建了PxbHLH01和PxbHLH02的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型，并構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。
　　應(yīng)用楊樹(shù)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫(kù)等軟件，分析了在毛果楊中，PxbHLH01和PxbHLH02同源基因的表達(dá)情況。
　　2、優(yōu)化了小黑楊組培體系并獲得轉(zhuǎn)基因小黑楊組培苗
　　本研究中，對(duì)小黑楊的組培體系進(jìn)行了優(yōu)化，最終確定了小黑楊組培最優(yōu)條

5、件為1/2 MS∶NAA0.5mg/L，IBA0.05mg/L。確定了愈傷組織再生途徑（葉片、莖段→愈傷→出芽）為最佳小黑楊轉(zhuǎn)基因再生培養(yǎng)方法，并成功獲得PxbHLH01/PxbHLH02過(guò)量表達(dá)小黑楊轉(zhuǎn)基因植株。
　　PCR分子檢測(cè)表明，PxbHLH01/PxbHLH02基因已經(jīng)整合到小黑楊的基因組中。非轉(zhuǎn)基因小黑楊在正常培養(yǎng)條件下，葉片呈鮮綠色，葉片飽滿，主根較細(xì)長(zhǎng)，且分支較多。獲得轉(zhuǎn)基因小黑楊的葉片呈鮮綠色，葉飽滿，莖粗壯，

6、與非轉(zhuǎn)基因小黑楊相比，根部的變化明顯:主根很短，明顯增粗，分支較少，且根毛明顯增多。
　　3、PxbHLH01和PxbHLH02基因上游調(diào)控通路的研究
　　本研究中獲得了PxbHLH01和PxbHLH02基因啟動(dòng)子序列，分別為1360bp和1913bp。經(jīng)過(guò)比對(duì)，與毛果楊未知功能基因（XM_002320932.1）啟動(dòng)子的一致性分別為95.17％和68.91％;與毛果楊未知功能基因(XM_002301486.1)啟動(dòng)子的一致

7、性分別為69.46％和96.25％。
　　順式作用元件分析表明，所獲得的啟動(dòng)子序列具有啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的必要元件。同時(shí)，存在一些逆境調(diào)控、激素調(diào)控、光調(diào)控和代謝相關(guān)的一些元件。啟動(dòng)子中有大量的抗脅迫功能元件，而這些逆境調(diào)控元件中，脫水響應(yīng)基因占有較大比例，同時(shí)含有多個(gè)氧應(yīng)答元件(CURECORECR)。
　　本研究根據(jù)PxbHLH01和PxbHLH02基因啟動(dòng)子，將上游啟動(dòng)子1000bp左右序列引入pAbAi載體，成功構(gòu)建pAbAi