二化螟氣味結合蛋白的基因克隆、組織分布及配體結合能力分析.pdf

1、在長期的進化過程中，昆蟲形成了高度靈敏的嗅覺系統(tǒng)，并以此來感受外界環(huán)境中的氣味物質，從而做出相應的行為或生理反應，如尋找配偶、食物和棲息場所等。昆蟲的嗅覺分為外周和中樞神經(jīng)感受兩個過程，在外周神經(jīng)感受過程中，嗅覺感器腔內大量存在氣味結合蛋白(Odorantbindingproteins，OBPs)負責將進入到感器腔內的脂溶性氣味物質結合并運輸?shù)轿挥诟惺苌窠?jīng)膜上的氣味受體(Odorantreceptor,OR)，因此OBP和氣味物質的作用

2、是昆蟲嗅覺的第一個生化步驟。二化螟Chilosuppressalis(Walker)是一種重要的農(nóng)業(yè)害蟲，對其OBP的研究，不僅有助于深入理解昆蟲的嗅覺機制，而且可以為開發(fā)高效行為調控技術提供新的靶標基因，提高二化螟的可持續(xù)防治水平。然而，國內外有關二化螟OBP的研究較少，本研究利用所在研究組測得的二化螟基因組數(shù)據(jù)，通過生物信息學和分子生物學相結合的方法，得到26個OBP基因的cDNA片段，并進一步克隆得到其中6個OBP基因的全長cDN

3、A序列。在此基礎上，測定5個OBP基因的組織表達譜，并利用蛋白體外表達技術及熒光競爭結合實驗初步探討了其中一個OBP的生理功能。主要結果如下:
　　1.二化螟OBP基因的克隆及序列分析
　　結合基因組數(shù)據(jù)分析并利用PCR技術，獲得了29個OBP基因cDNA片段并對其中的26個進行了成功驗證，進一步克隆了其中6個OBP的全長cDNA序列，分別命名為CsupOBP1、CsupOBP2、CsupOBP3、CsupOBP4、Csup

4、OBP5和CsupABPX。序列分析表明，CsupOBP3、CsupOBP4和CsupABPX具有6個保守的半胱氨酸位點，屬典型的OBP基因;但CsupOBP1、CsupOBP2和CsupOBP5只有4個保守的半胱氨酸位點，為Minus-COBP基因。CsupOBP2、CsupOBP3、CsupOBP4和CsupABPX的氨基酸序列與其它鱗翅目昆蟲OBP具有很高的相似性，分別為81％、66％、61％、70％;CsupOBP1和CsupO

5、BP5的氨基酸序列與其它鱗翅目昆蟲OBP的相似性較低，分別為34％、43％。
　　2.二化螟OBP基因在不同組織的表達量分析
　　為了探討CsupOBP基因的功能，利用RT-qPCR技術檢測并比較了CsupOBP1、CsupOBP2、CsupOBP4、CsupOBP5和CsupABPX等5個基因在幼蟲及雌雄成蟲不同組織中的表達量。結果表明，在幼蟲期4個OBP主要在頭部表達，以CsupOBP1基因的表達量最高，其次是CsupO

6、BP2，而CsupOBP5和CsupABPX基因的表達量很低。在成蟲期，CsupABPX主要在觸角表達，在其他組織幾乎不表達;CsupOBP2主要在頭部表達，在其他組織少量或不表達;CsupOBP1在不同組織中都有表達，但以足、翅及雄性觸角和頭部的表達量較高;CsupOBP4和CsupOBP5主要在腹部高表達。這些CsupOBP基因在幼蟲頭部、成蟲觸角等化感組織中的高表達，暗示它們在二化螟的嗅覺或味覺中起重要作用。
　　3.二化螟

7、CsupOBP1的原核表達及配體結合能力分析
　　鑒于CsupOBP1基因在幼蟲期頭部、成蟲期雄性觸角及雌雄足、翅中均有較高表達，推測其在二化螟的嗅覺及味覺中起重要作用，為此進一步進行了體外功能研究。首先將該基因構建到pET-30a(+)表達載體中，在大腸桿菌Escherichiacoli中經(jīng)IPTG誘導進行大量表達，表達產(chǎn)物經(jīng)鎳離子親和層析、腸激酶酶解等步驟，得到純化的CsupOBP1蛋白。然后以1-NPN為探針，利用熒光競爭結

8、合實驗，測定了CsupOBP1對38種不同氣味物質的結合能力。結果表明，在被測氣味物質中，CsupOBP1只與β-紫羅蘭酮具有較強的結合能力，Ki值為9.53μM。p-紫羅蘭酮是包括二化螟寄主在內的很多植物中普遍存在的一種芳香氣味組分，因此，CsupOBP1可能通過對該氣味物質的識別從而在二化螟對寄主植物的定向中起作用。
　　4.二化螟成蟲對β-紫羅蘭酮等植物揮發(fā)性化合物的EAG反應
　　上述配體結合實驗結果認為，CsupO