家鴨人工感染鴨瘟強毒株的動態(tài)分布、黏膜免疫及對腸道菌群結構的影響.pdf

1、鴨瘟(DuckPlague，DP)又稱鴨病毒性腸炎(DuckViralEnteritis，DVE)，是由鴨瘟病毒(DuckPlagueVirus，DPV)引起的常見于鴨、鵝等雁行目禽類的一種急性敗血性的接觸性傳染病。黏膜免疫是指發(fā)生在機體與外界相通腔道黏膜表面的免疫。黏膜免疫系統(tǒng)(Mucosalimmunesystem，MIS)是在一定程度上獨立存在于系統(tǒng)免疫系統(tǒng)之外的免疫系統(tǒng)，能對某些病原微生物產(chǎn)生有效的免疫，同時對絕大部分來自外界的

2、無害物質(zhì)或營養(yǎng)物質(zhì)產(chǎn)生免疫耐受，是機體抵抗病原微生物通過黏膜入侵的重要防線。本研究對DPV強毒經(jīng)不同途徑感染鴨的呼吸道和消化道等局部黏膜免疫的發(fā)生和變化規(guī)律進行了檢測、應用ERIC-PCR技術對腸道菌群結構的多樣性和動態(tài)變化進行了初步研究和分析，獲得以下系列結果： 1.分別采用飽和硫酸銨沉淀法和不同濃度聚乙二醇PEG-6000沉淀法從鴨膽汁中粗提IgA，經(jīng)Micro-PrepS離子交換介質(zhì)純化后，通過SDS-PAGE和ELISA

3、檢測純度和活性。結果表明：終濃度15％的PEG-6000沉淀可從鴨膽汁中獲得電泳純的IgA，其產(chǎn)量最高，活性最好；經(jīng)終濃度22％PEG-6000和飽和硫酸銨沉淀，Micro-PrepS離子交換介質(zhì)純化所得IgA，其產(chǎn)量和活性均明顯下降。將純化后的IgA免疫兔，獲得了高效價的兔抗鴨IgA血清，結合辛酸-硫酸銨法粗提和離子交換層析純化，獲得了純度較高的兔抗鴨IgA的IgG。 2.結合硫酸銨沉淀和Sepharose4B分子篩層析法，從

4、鴨富集IgM血清中，分離純化IgM。經(jīng)SDS-PAGE電泳、瓊脂擴散和2-巰基乙醇試驗分析，結果顯示：硫酸銨沉淀的免疫球蛋白經(jīng)Sepharose4B分子篩層析后，第一個蛋白洗脫峰為達電泳純的IgM。采用與上一章相同的方法，獲得了達電泳純的兔抗鴨IgM的IgG。 3.應用TaqMan-MGB探針實時熒光定量PCR對DPV強毒經(jīng)皮下、口服、滴鼻和同居感染20日齡鴨后，在鴨體內(nèi)的增殖分布規(guī)律進行檢測。結果表明：DPV分布到各組織器官的

5、速度與感染的途徑和鴨的解剖結構密切相關，皮下注射是DPV分布到各組織器官速度最快的途徑。DPV經(jīng)皮下、口服和滴鼻感染鴨后，能在30min內(nèi)通過血液首先到達離感染部位最近的免疫器官繁殖，鴨免疫器官抗DPV感染的重要性依次是脾臟、胸腺、法氏囊和哈德氏腺。腸道尤其是盲腸和回盲處是DPV感染機體后期，病毒增殖最快的部位。DPV分布到免疫器官和腸道的速度和數(shù)量決定了DPV感染的潛伏期和疾病的嚴重程度。DPV致死鴨的法氏囊和腎是DPV-DNA含量最

6、高的實質(zhì)器官。 4.通過本實驗建立的DPV特異性SIgA、IgG和IgM間接ELISA檢測方法，對DPV強毒經(jīng)不同途徑感染20日齡鴨后，鴨血液、膽汁、呼吸道和消化道分泌液中的DPV特異性SIgA、IgG和IgM的消長規(guī)律進行了監(jiān)測。結果表明：除皮下攻毒鴨外，均可在其它感染鴨上呼吸道和消化道分泌液中檢測到SIgA，且抗體滴度最高，維持時間最長，SIgA是鴨MIS抗DPV感染的主要體液免疫因子，上呼吸道和消化道是鴨MIS的重要組成部

7、分。IgM在所有受檢體液中檢出時間最早，是機體抗DPV感染早期的主要抗體。IgG在血清中的抗體滴度最高，維持時間較長，是系統(tǒng)免疫的主要體液免疫因子，DPV經(jīng)呼吸道和消化道感染鴨后，能同時激活MIS和系統(tǒng)免疫系統(tǒng)。膽汁中抗DPV特異性SIgA的抗體滴度較呼吸道和消化道分泌液中SIgA的抗體滴度高。 5.建立了IgA生成細胞的間接免疫過氧化物酶組織化學染色檢測法(IISM)，該法具有特異性好、敏感性高的優(yōu)點。應用該法對20日齡不同途

8、徑感染DPV強毒鴨的消化道、呼吸道和主要免疫器官石蠟切片中IgA生成細胞的變化規(guī)律進行檢測。結果顯示：除DPV皮下感染鴨各組織器官中IgA生成細胞數(shù)量下降或變化不明顯外，其它組鴨腸道黏膜固有層尤其是十二指腸黏膜固有層中的IgA生成細胞較正常鴨明顯增加，鴨黏膜固有層是鴨黏膜免疫最大的效應位點，十二指腸黏膜固有層是腸相關淋巴組織(GALT)的主要效應位點?？诜腥绝喯繧gA生成細胞數(shù)量出現(xiàn)增加的時間較滴鼻感染鴨早，數(shù)量多；而滴鼻感染鴨呼

9、吸道IgA生成細胞增加的時間早于口服感染鴨，達到高峰的時間要比口服感染鴨早3d，鴨既存在局部黏膜免疫系統(tǒng)，又存在共同黏膜免疫系統(tǒng)(CMIS)?？诜偷伪歉腥绝喌姆ㄊ夏?、脾臟和哈德氏腺中IgA生成細胞數(shù)量都有不同程度的增加。 6.本研究成功建立了具有良好特異性和敏感性的CD3+細胞和DPV順序間接免疫過氧化物酶檢測方法。應用該法同時對DPV強毒經(jīng)不同途徑感染20日齡鴨的消化道、呼吸道和主要免疫器官石蠟切片中CD3+細胞和DPV進行

10、檢測。結果表明：不同途徑感染鴨的消化道、呼吸道和免疫器官的黏膜上皮細胞中均可在攻毒后1d-3d檢測到DPV，其中腸道黏膜上皮細胞(IEC)是DPV最早侵噬的靶細胞之一。消化道中DPV與CD3+細胞的增殖規(guī)律具有一定的相關性。DPV皮下感染鴨的消化道和呼吸道黏膜固有層的CD3+細胞漿中可見DPV陽性染色。脾臟淋巴細胞、法氏囊黏膜上皮細胞(皮質(zhì)和髓質(zhì)的淋巴細胞)、哈德氏腺腺泡上皮淋巴細胞均可見DPV陽性染色，且CD3+細胞漿中也可見DPV陽

11、性染色。同一時間段脾臟、胸腺、法氏囊和哈德氏腺中CD3+細胞數(shù)量依次降低。 7.建立了分析鴨腸道菌群結構的ERIC-PCR方法，并應用其對DPV強毒株經(jīng)不同途徑感染20日齡鴨各腸段中細菌菌群結構的多樣性和動態(tài)變化進行檢測。結果表明：正常鴨腸道內(nèi)的菌群結構相對穩(wěn)定，其中十二指腸和空腸的ERIC-PCR條帶最少，盲腸最多。DPV感染鴨腸道菌群失調(diào)的程度與DPV感染途徑密切相關，以皮下感染鴨最為明顯，其它組依次是皮下感染同居鴨、口服感