水牛精液蛋白質組學的相關研究.pdf

1、精液與雄性生殖疾病密切相關，近年來，蛋白質組學的出現(xiàn)為精液研究提供了新的有效的研究方法。迄今為止，蛋白質組學已運用在人、鼠等多種動物的精液研究中，促進了精子發(fā)生分子機理的認識和雄性生殖疾病治療。本研究主要在實驗室前期研究的基礎上，對水牛精液進行更為深入的研究，進一步優(yōu)化水牛精液蛋白質組學體系，為后續(xù)的差異蛋白質組學提供良好的技術支撐。此外，分離鑒定高、低活力水牛精子之間以及高畸形率、正常精子之間的表達差異蛋白，為理解活力低下、形態(tài)異常的

2、機制奠定理論基礎。
　　 第一章：通過比較IPG膠條的長度、線性或非線性、上樣量、SDS-PAGE膠濃度、純化蛋白的方法等參數(shù)，優(yōu)化水牛精子蛋白雙向電泳蛋白質組學體系。試驗結果顯示，用丙酮沉淀法純化蛋白，上樣量350μg，并使用24 cmpH3-10 NL IPG膠條，濃度12.5％的SDS-PAGE膠進行雙向電泳，能獲得了分辨率高、質量更好的含有約500多個蛋白點的水牛精子蛋白2-DE圖譜。
　　 第二章：運用已優(yōu)化的

3、雙向電泳技術體系分離高、低活力水牛精子蛋白，使用ImageMaster2.0軟件比較分析兩者2-DE圖譜，并結合基質輔助激光解吸附電離-飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)和生物信息學鑒定差異蛋白點。本章試驗建立了高、低活力的水牛精子差異蛋白表達的2-DE圖譜，并篩選得到18個差異蛋白點，其中有5個蛋白點在低活力的水牛精子中表達下調，8個表達上調，1個缺失，4個在高活力水牛精子中缺失。最終，質譜成功鑒定了其中4個，分別對應3種蛋白：

4、精子尾部結構蛋白2、α-ATP合成酶、α-琥珀酰輔酶A合成酶。精子尾部結構蛋白2、α-ATP合成酶在低活力精子中表達下調，α-琥珀酰輔酶A合成酶表達上調，這些差異點可能與精子活力相關。
　　 第三章與第二章的試驗方法一致。本章試驗建立了高畸形率、正常水牛精子蛋白雙向電泳差異蛋白表達譜，并篩選得到16個表達差異明顯的蛋白點，其中5個蛋白點在畸形率高的水牛精子中表達量上調，6個表達量下調，3個缺失，2個在正常水牛精子中缺失。并運用質

5、譜成功鑒定了6個，分別對應4種蛋白：左旋天冬酰胺酶、熱應激蛋白、半乳糖激酶、β-微管蛋白。左旋天冬酰胺酶、熱應激蛋白、半乳糖激酶在畸形率高的水牛精子上表達量上調，β-微管蛋白表達量則下降。這些差異點與精子結構、代謝等有關，可能與精子形態(tài)結構異常相關聯(lián)。
　　 第四章試驗主要通過對比不同上樣量，進一步優(yōu)化水牛精漿雙向電泳體系，并使用質譜技術鑒定部分水牛精漿蛋白。結果表明，300μg的上樣量優(yōu)于200μg和300μg，使用300μg

6、上樣量于非線性的24 cm pH3-10的IPG膠條，獲得了蛋白點500多個的水牛精漿2-DE圖譜。質譜鑒定103個豐度相對較高的水牛精漿蛋白點，最終27個被成功鑒定，分別對應15種蛋白：血清白蛋白、血清轉鐵蛋白、T-復合蛋白1-β、磷酸甘油酸激酶、山梨醇脫氫酶、果糖-1，6-二磷酸酶、肌動蛋白、鋅α2糖蛋白、過敏原Bosd2、牛精清蛋白-30kDa、過氧化還原酶-5、附睪分泌蛋白E1、溶菌酶c-3、核糖核酸酶、磷酸變位酶。