面包烘烤品質(zhì)基因1Dx5在冬小麥新冬-26中的遺傳轉(zhuǎn)化及后代檢測.pdf

1、本文以新疆主栽耐鹽冬小麥(Triticun aestivum L)品種新冬-26作為研究對(duì)象,采用基因工程手段,通過制備面包品質(zhì)主效基因1Dx5的線性核心片段,采用花粉管通道方法實(shí)現(xiàn)線性1Dx5核心片段在新冬-26中遺傳轉(zhuǎn)化,獲得轉(zhuǎn)基因小麥植株;并利用SDS-PAGE手段和Multiplex-PCR技術(shù)檢測和分析外源基因在轉(zhuǎn)基因后代中的遺傳表達(dá)情況,以期獲得安全型的強(qiáng)筋與耐鹽并舉的轉(zhuǎn)基因小麥株系。這不僅為保障糧食安全提供了新型的種質(zhì)資源

2、,進(jìn)而加快了干旱區(qū)高品質(zhì)小麥的生產(chǎn)步伐,同時(shí)對(duì)利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)手段改良我國小麥加工品質(zhì)、培育資源高效型農(nóng)作物等都具有重大的理論價(jià)值和實(shí)踐意義。
　　主要研究結(jié)果如下:
　　(1)小麥及其近緣種1Dx亞基基因的比較分析:利用生物信息學(xué)手段,對(duì)所選1Dx型亞基的核酸、蛋白質(zhì)一、二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較和分析。結(jié)果顯示:在核酸的水平上,其相似性高達(dá)96.58％,存在有90個(gè)SNPs;SNPs造成氨基酸水平上出現(xiàn)53個(gè)氨基酸的替換;在

3、氨基酸水平上,其相似性高達(dá)96.74％,并存在7處氨基酸肽段的缺失/插入;在預(yù)測的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)水平上,相似性高達(dá)97.71％,其中SNPs可能造成四處二級(jí)結(jié)構(gòu)單元的改變,同時(shí)重復(fù)序列的插入和缺失影響二級(jí)結(jié)構(gòu)中無規(guī)卷曲的長短,其可能是影響蛋白質(zhì)亞基的生物學(xué)功能的主要因素。通過分析各基因在DNA和蛋白質(zhì)水平上存在的差異和聯(lián)系,探究各基因在功能上差異的原因,并在一定程度上揭示各基因在分子結(jié)構(gòu)、生物學(xué)功能和物種進(jìn)化三者之間的關(guān)系,為后期外源基

4、因的檢測奠定理論基礎(chǔ)和提供強(qiáng)有力的技術(shù)方案。
　　(2)外源基因的遺傳轉(zhuǎn)化和檢測:以小麥品種新冬-26(Null,7+8,2+12)為實(shí)驗(yàn)材料,采用花粉管通道法將線性1Dx5基因核心片段和pHMW1Dx5分別導(dǎo)入到受體材料中,利用蛋白質(zhì)檢測手段,分析轉(zhuǎn)基因小麥T0代HMW-GS的組成情況。結(jié)果顯示,線性1Dx5基因轉(zhuǎn)基因小麥T0代籽粒中有5條高分子量麥谷蛋白亞基條帶,分別是1Dx2、1Bx7+1By8和1Dy12,一條新的蛋白質(zhì)亞

5、基-BandX,遷移率快于1Dx5,其頻率為0.2％;pHMW1Dx5轉(zhuǎn)基因小麥T0代籽粒也產(chǎn)生了新蛋白質(zhì)條帶,其遷移率慢于1Dx2,其頻率為0.15％。
　　(3)pHMW1Dx5轉(zhuǎn)基因小麥后代中外源基因的檢測和分析:結(jié)果顯示,采用PCR技術(shù),在轉(zhuǎn)基因T0代植株中擴(kuò)增出1Dx5基因的特異片段大小為450 bp,表明外源基因已整合到受體基因組中;SDS-PAGE分析T1代籽粒外源基因的表達(dá),表明外源基因插入受體基因組中并表達(dá),引起

6、了轉(zhuǎn)基因T1代籽粒中HMW-GS組成的變化,獲得了pHMW1Dx5轉(zhuǎn)基因小麥株系。本實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了借助花粉管通道法轉(zhuǎn)化外源基因的遺傳轉(zhuǎn)化策略是可行的,并使得外源基因在轉(zhuǎn)基因后代植株中遺傳表達(dá),為線性基因片段直接轉(zhuǎn)化體系的建立奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
　　(4)線性1Dx5轉(zhuǎn)基因小麥后代中外源基因的檢測和分析:通過建立Multiplex PCR體系和運(yùn)用SDS-PAGE技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)1Dx5基因小麥后代進(jìn)行了檢測和分析。結(jié)果顯示,Multiplex