暗黑鰓金龜氣味結(jié)合蛋白的基因克隆及功能研究.pdf

1、金龜子屬鞘翅目昆蟲(chóng)，是農(nóng)林牧業(yè)生產(chǎn)中一類(lèi)重要的土棲害蟲(chóng)。暗黑鰓金龜（Holotrichiaparallela）為我國(guó)金龜子優(yōu)勢(shì)種，其幼蟲(chóng)蠐螬危害花生、大豆、地瓜、玉米、草坪、花卉、蔬菜等多種作物，常造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。由于長(zhǎng)期依賴(lài)化學(xué)農(nóng)藥防治，不僅使暗黑鰓金龜抗藥性不斷增強(qiáng)，同時(shí)也明顯削弱了自然天敵的控制能力。隨著人類(lèi)環(huán)保意識(shí)的增強(qiáng)，對(duì)害蟲(chóng)的防治措施有了新的要求，不僅要有效控制害蟲(chóng)，還要保證對(duì)人畜和其賴(lài)以生存的環(huán)境的安全。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外

2、專(zhuān)家學(xué)者將注意力轉(zhuǎn)向了昆蟲(chóng)的行為調(diào)控，利用天然的或其自身的化學(xué)通訊物質(zhì)——信息素，研制引誘劑用于防治害蟲(chóng)。行為調(diào)控是一種新型的治蟲(chóng)技術(shù)，引誘劑不與作物直接接觸，專(zhuān)一性極強(qiáng)，與化學(xué)農(nóng)藥相比，不會(huì)產(chǎn)生高殘留、污染環(huán)境、害蟲(chóng)再猖獗及抗藥性等問(wèn)題。探討昆蟲(chóng)感受氣味分子的機(jī)制，可對(duì)開(kāi)發(fā)高效行為調(diào)控劑提供重要的知識(shí)積累。本文針對(duì)金龜子的防治現(xiàn)狀，以暗黑鰓金龜為試蟲(chóng)，重點(diǎn)對(duì)參與暗黑鰓金龜氣味感受的氣味結(jié)合蛋白(OBP)及其功能，以及引誘物的田間引誘效

3、果進(jìn)行了研究，主要結(jié)果如下:
　　1暗黑鰓金龜氣味結(jié)合蛋白基因的克隆、序列分析和表達(dá)譜研究
　　通過(guò)RACE技術(shù)獲得暗黑鰓金龜HparOBP1和HparOBP2全長(zhǎng)cDNA，Genbank登錄號(hào)分別為GQ395804和JF422903。對(duì)HparOBPs分析發(fā)現(xiàn)，HparOBP1和HparOBP2具有典型的昆蟲(chóng)OBP結(jié)構(gòu)特征:含有保守的6個(gè)半胱氨酸位點(diǎn)和信號(hào)肽序列，且第2和第3個(gè)半胱氨酸間隔3個(gè)氨基酸、第5和第6個(gè)半胱氨酸間

4、隔8個(gè)氨基酸。通過(guò)HparOBP1和HparOBP2氨基酸序列相似性分析，發(fā)現(xiàn)兩者相似性?xún)H有14.6％。將暗黑鰓金龜HparOBPs氨基酸序列與其他幾種昆蟲(chóng)OBPs的氨基酸序列比較，結(jié)果顯示HparOBP1較HparOBP2相對(duì)保守，HparOBP1和HparOBP2分別與大黑鰓金龜HoblOBPl(ACX32050)(83％)和HoblOBP2(ACX32049)(78％)的相似度最高。對(duì)HparOBP1和HparOBP2進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育

5、進(jìn)化分析，結(jié)果顯示HparOBP1和HparOBP2明顯的被分到兩個(gè)簇中，但兩者都與大黑鰓金龜有較高的相似性。以半定量PCR對(duì)HparOBPs進(jìn)行組織表達(dá)譜分析，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HparOBP1和HparOBP2在雌雄觸角中均有高表達(dá)，在其他組織中無(wú)明顯表達(dá)。上述結(jié)果暗示，HparOBP1和HparOBP2與暗黑鰓金龜?shù)那笈己鸵捠承袨橄嚓P(guān)。
　　2暗黑鰓金龜氣味結(jié)合蛋白HparOBP1和HparOBP2的功能研究
　　為確定上

6、述HparOBPs基因的功能，利用帶有酶切位點(diǎn)的特異引物，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到帶有相同酶切位點(diǎn)的pET-30a(+)原核表達(dá)載體，構(gòu)建pET-HparOBPs重組表達(dá)載體。37℃下，利用0.2mMIPTG誘導(dǎo)HparOBPs在大腸桿菌異源表達(dá)系統(tǒng)中過(guò)表達(dá)，誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間為4h。SDS-PAGE電泳分析菌液粗提物，顯示HparOBP1以包涵體形式存在，HparOBP2則是可溶性蛋白。利用兩者攜帶的His標(biāo)簽親和特性，通過(guò)鎳柱親和層析得到純

7、度較高且具高活性的重組蛋白。采用熒光競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)的方法對(duì)HparOBPs重組蛋白與不同氣味分子的親和力進(jìn)行了測(cè)定。11種氣味分子配基（其中2種性信息素物質(zhì)和8種暗黑鰓金龜寄主植物揮發(fā)物質(zhì)或次生物）中有9種小分子物質(zhì)可以與HparOBP1和HparOBP2相結(jié)合。其中法尼醇(Farnesol)，月桂酸(lauricacid)，異亮氨酸甲酯(LIME，主要信息素物質(zhì))，反式-2-己烯-1-醇(E-2-hexen-1-ol)，檸檬烯(limo

8、nene)和α-蒎烯(α-pinene)只與HparOBP1相結(jié)合，解離常數(shù)分別為4.1，5.2，10.6，10.7，11.0，16.8。苯甲醛(Benzaldehyde)和芳樟醇(linalool，次要信息素物質(zhì))只與HparOBP2結(jié)合，解離常數(shù)分別為12.9and18.8。3-己烯-1-醇(3-hexen-1-ol，acetate)與HparOBP1和HparOBP2兩者都有結(jié)合活性，且結(jié)合活性相似，分別為30.0和29.5。以上

9、結(jié)果表明HparOBP1和HparOBP2在暗黑鰓金龜求偶和覓食中起到重要作用。
　　3暗黑鰓金龜對(duì)生物引誘劑的趨向反應(yīng)及田間應(yīng)用研究
　　選取可與HparOBP1和HparOBP2結(jié)合的性信息素物質(zhì)和植物源氣味分子及其衍生物，進(jìn)行室內(nèi)電生理和田間試驗(yàn)，以尋找和確定暗黑鰓金龜性誘劑和植物誘劑的實(shí)際田間引誘效果。在植物誘劑研究方面，不同寄主植物葉片對(duì)雌蟲(chóng)的引誘作用差異較顯著，雌雄蟲(chóng)分別對(duì)榆樹(shù)和桑樹(shù)表現(xiàn)出較強(qiáng)的趨向反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)選取

10、了15種植物源氣味分子對(duì)暗黑鰓金龜進(jìn)行EAG反應(yīng)測(cè)試，結(jié)果顯示15種氣味分子均能引起暗黑鰓金龜觸角的EAG反應(yīng)，但反應(yīng)強(qiáng)弱各異。雄蟲(chóng)觸角對(duì)苯甲醛和α-蒎烯的EAG反應(yīng)值顯著高于其他氣味分子，分別為2.63±0.14和2.54±0.12;雌蟲(chóng)觸角對(duì)氣味分子羅勒烯的EAG反應(yīng)值最高，為1.76±0.09。選取對(duì)雌雄蟲(chóng)有較高EAG反應(yīng)的9種物質(zhì)進(jìn)行田間引誘實(shí)驗(yàn)，就誘蟲(chóng)總量而言，α-蒎烯對(duì)雌雄蟲(chóng)的引誘效果相對(duì)好于其他氣味分子，其次為順-2-己烯

11、-1-醇;就誘蟲(chóng)性別而言，誘芯誘到的雄蟲(chóng)數(shù)量均大于誘到雌蟲(chóng)的數(shù)量;但不同氣味對(duì)暗黑鰓金龜雌、雄蟲(chóng)誘蟲(chóng)量和誘蟲(chóng)總量均無(wú)顯著性差異。兩種引誘物質(zhì)的確定為暗黑鰓金龜食誘劑的研制和開(kāi)發(fā)奠定了基礎(chǔ)。
　　在山東青島、遼寧錦州、河北保定、河南開(kāi)封、山東臨沂、安徽蚌埠、江蘇如皋、泰興、湖北襄樊8個(gè)地方開(kāi)展了暗黑鰓金龜性誘劑田間試驗(yàn)。本試驗(yàn)所采用的誘芯及誘捕器對(duì)暗黑鰓金龜成蟲(chóng)的誘捕效果明顯。其中襄樊市在全部性誘劑防治的試點(diǎn)中保果效果和防蟲(chóng)效果最好

12、，宜城和襄陽(yáng)兩個(gè)試點(diǎn)的保果效果分別為66.0％和68.6％，幼蟲(chóng)減退率分別為78.8％和75.0％，同時(shí)發(fā)現(xiàn)此地區(qū)每日誘蟲(chóng)量并無(wú)明顯大小日現(xiàn)象，不符合暗黑鰓金龜隔日出土特性，這一特性或存在地域性。暗黑鰓金龜性誘劑在全國(guó)多地的田間試驗(yàn)結(jié)果為其大面積推廣提供了技術(shù)支持。
　　4暗黑鰓金龜轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)的Solexa測(cè)序及OBP基因和CSP基因的組織表達(dá)譜分析
　　為尋找更多的功能性O(shè)BPs，利用Solexa高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)暗黑鰓金龜

13、轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了測(cè)序。測(cè)序所得數(shù)據(jù)產(chǎn)量堿基數(shù)約合4.5G，共得到Unigenes43，967條。利用GO數(shù)據(jù)庫(kù)分析數(shù)據(jù)顯示共有21，512個(gè)預(yù)測(cè)蛋白匹配149，270項(xiàng)GOterms。所有Unigenes中，58，834條Unigenes參與11類(lèi)細(xì)胞組分的構(gòu)成，60，054條Unigenes歸入25類(lèi)分子功能項(xiàng)中，74，988條Unigenesto參與21類(lèi)生物學(xué)過(guò)程。根據(jù)Unigenes和COG數(shù)據(jù)庫(kù)的比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其中共有19，992

14、個(gè)Unigenes比對(duì)上該數(shù)據(jù)庫(kù)，這些Unigenes所表達(dá)的蛋白涉及26個(gè)不同的功能分類(lèi)，最多數(shù)量的Unigenes比對(duì)到了COG數(shù)據(jù)庫(kù)的一般代謝這一功能項(xiàng)（8，091條），比對(duì)到細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性(116條)和輔酶的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝(223條)兩功能項(xiàng)的Unigenes數(shù)最少。KEGG代謝通路分析顯示，共有4，849個(gè)蛋白獲得了KOnumber，這些蛋白共參與37條代謝途徑，與暗黑鰓金龜氣味識(shí)別和運(yùn)輸相關(guān)的代謝涉及到信號(hào)分子互作、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及膜運(yùn)

15、輸。
　　通過(guò)對(duì)暗黑鰓金龜轉(zhuǎn)錄組蛋白序列的特異搜尋，共找到了25個(gè)全長(zhǎng)HparOBPs基因和16個(gè)全長(zhǎng)HparCSPs基因。共有20個(gè)HparOBPs基因和13個(gè)HparCSPs基因驗(yàn)證成功。HparOBPs序列分化較大，氨基酸個(gè)數(shù)從113到223不等，半胱氨酸個(gè)數(shù)最高可達(dá)13個(gè)。25個(gè)HparOBPs中含有2個(gè)HparPBPs，3個(gè)HparASPs，1個(gè)HparGOBP和19個(gè)HparOBPs。16個(gè)HparCSPs的氨基酸數(shù)從

16、375bp-408bp不等。氨基酸比對(duì)顯示HparCSPs具有保守的Four-cysteinemotif。半定量結(jié)果顯示，9個(gè)HparOBPs基因是觸角特異表達(dá)的，分別為HparOBP1、parOBP2、parOBP3、parOBP4、HparOBP9、HparOBP17、HparOBP18、HparASP1和HparPBP1;HparCSP1、HparCSP7和HparCSP12僅在觸角中表達(dá);其中HparOBP17和HparCSP7