海洋酵母菌新型菊粉酶基因的克隆及表達(dá).pdf

1、菊粉(inulin)是D-呋喃果糖分子由β-2,1-糖苷鍵連接組成的鏈狀多糖，其末端有一個(gè)葡萄糖殘基以α-2,1-糖苷鍵與之相連。菊粉廣泛存在于菊芋(Jerusalem artichoke)、雪蓮果(Yacon)、菊苣(Chicory tubes)和牛蒡(Arctium)等多種植物中。菊粉酶(inulinase)是一種呋喃果糖基水解酶，它靶向作用于菊粉中的β-2,1糖苷鍵并將其水解為果糖和葡萄糖。菊粉酶可以分為外切菊粉酶和內(nèi)切菊粉酶。外

2、切菊粉酶可以從菊粉分子的非還原末端催化水解下D-呋喃果糖殘基,其底物可為菊粉、蔗糖、果聚糖；內(nèi)切菊粉酶可以水解菊粉內(nèi)部的β-2,1糖苷鍵使其變成菊糖三糖、菊糖四糖、菊糖五糖為主的低聚果糖。在本研究中為了了解海洋酵母菌菊粉酶基因及其功能和應(yīng)用，分別克隆了海洋隱球酵母Cryptococcus aureus HYA菌株的菊粉酶基因和海洋酵母Candida membranifaciens subsp.flavinogenie W14-3菌株的菊

3、粉酶基因，同時(shí)將從C.aureus HYA菌株克隆得到的菊粉酶基因HYAINU1分別在Pichia pastoris和Saccharomyces cerevisiae中表達(dá)。
　　C.aureus HYA菌株具有菊粉酶活性，從C.aureus HYA菌株中克隆的菊粉酶基因HYAINU1基因登錄號(hào)為JX073660，該菊粉酶基因的ORF框共1653bp，基因中不含內(nèi)含子，翻譯550個(gè)氨基酸，氨基酸序列中的前23個(gè)為信號(hào)肽部分，蛋白預(yù)

4、測(cè)分子量大小為59.5kDa。在該菊粉酶氨基酸序列中含有酵母外切菊粉酶的保守序列WMNDPNGL、RDP、ECP、FS和Q，同時(shí)含有2個(gè)N-糖基化位點(diǎn)。在啟動(dòng)子中含有1個(gè)TATA框、2個(gè)5′-SYGGRG-3′序列，若干5′-CGG-3′序列。5′-SYGGRG-3′序列是Mig1中C2H2鋅指蛋白的錨定位點(diǎn)，說(shuō)明該基因表達(dá)受到葡萄糖阻遏。而5′-CGG-3′序列是轉(zhuǎn)錄激活蛋白Zn(II)2Cys6的錨定位點(diǎn)，說(shuō)明該基因表達(dá)受到底物誘導(dǎo)

5、。
　　將菊粉酶基因HYAINU1去掉信號(hào)肽部分，連接到pPICZaA表達(dá)載體中，在巴斯德畢赤酵母Pichia pastoris X-33中表達(dá)。表達(dá)的融合蛋白通過(guò)不連續(xù)SDS-PAGE凝膠電泳和Western Blot分析驗(yàn)證，得到蛋白分子量大小為60.0kDa左右的目的條帶。含有HYAINU1基因的P.pastoris X-33轉(zhuǎn)化子在培養(yǎng)過(guò)程中，培養(yǎng)液中測(cè)得的最高菊粉酶酶活力單位為16.3±0.24U/mL。該重組菊粉酶最適

6、反應(yīng)溫度為50℃，最適pH值為5.0。純化的重組菊粉酶水解菊粉后發(fā)現(xiàn)大量單糖，說(shuō)明C. aureus HYA菌株分泌的菊粉酶為外切菊粉酶。
　　將菊粉酶基因HYAINU1連接到pMIRSC11表達(dá)載體中在高產(chǎn)酒精酵母 W0菌株的尿嘧啶缺陷型菌株W12d中表達(dá)，篩選后得到轉(zhuǎn)化子MHYAINU1-69。該轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)到72h時(shí)酶活力為19.2±0.3U/mL。經(jīng)150mL體系的酒精發(fā)酵研究確認(rèn)最佳接種量和最適菊粉濃度分別為10.0％(v

7、/v)和25.0%(w/v)，當(dāng)發(fā)酵到120h時(shí)，酒精濃度可達(dá)到11.9%(v/v，20℃)。當(dāng)擴(kuò)大到3-L發(fā)酵體系，發(fā)酵時(shí)間為120h時(shí)發(fā)酵液酒精濃度為13.1±0.6%(v/v，20℃)。
　　分離自中國(guó)東海表層海水樣品的海洋酵母C.membranifaciens subsp.flavinogenie W14-3菌株可分泌核黃素，但也具有菊粉酶活性，W14-3菌株菊粉酶基因的基因登錄號(hào)為KC576811。該菊粉酶基因的ORF框