小麥胚乳特異性啟動(dòng)子的改造及其在創(chuàng)制小麥高賴氨酸轉(zhuǎn)基因新種質(zhì)中的應(yīng)用.pdf

1、賴氨酸為人體必需氨基酸，在人體新陳代謝中發(fā)揮重要作用，賴氨酸缺乏會(huì)導(dǎo)致人體中樞神經(jīng)發(fā)育不良，同時(shí)影響免疫功能。小麥?zhǔn)侨蜃钪匾募Z食作物之一，也是人類獲取植物蛋白質(zhì)最重要的來(lái)源。而一般小麥品種籽粒中賴氨酸含量很少，平均僅在0.44％左右，而一個(gè)健康成年人每天需要的賴氨酸量是30mg·kg-1，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足人體的需要，因此賴氨酸成為小麥籽粒營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)中第一限制性必需氨基酸，對(duì)其籽粒營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的影響非常大。常規(guī)育種技術(shù)在作物高賴氨酸育種中起到了

2、一定的推動(dòng)作用，尤其是在玉米和大麥中，但研究證明小麥賴氨酸的含量在不同品種間和種內(nèi)的變化均較小，因此通過(guò)品種間雜交和遠(yuǎn)緣雜交獲得小麥高賴氨酸品系的潛力很小。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展使在分子水平開(kāi)展小麥賴氨酸品質(zhì)育種成為可能。
　　 籽粒特異性表達(dá)的高活性啟動(dòng)子是通過(guò)基因工程手段提高小麥籽粒中賴氨酸含量的重要方法之一，本文旨在改造并獲得高活性人工啟動(dòng)子，并與辣椒中克隆的高賴氨酸蛋白基因Cflr構(gòu)建表達(dá)載體，通過(guò)基因槍法轉(zhuǎn)入小麥

3、，獲得高賴氨酸的轉(zhuǎn)基因小麥新種質(zhì)。
　　 高分子量麥谷蛋白亞基(GS)啟動(dòng)子是目前已知的高活性的胚乳特異性啟動(dòng)子。其中的Bx7超量表達(dá)亞基(Bx7OE)是近年發(fā)現(xiàn)對(duì)小麥品質(zhì)有重要貢獻(xiàn)的優(yōu)質(zhì)亞基，其啟動(dòng)子的活性強(qiáng)。本文根據(jù)已公布的HMW-GS Bx7基因序列(GenBank: DQ119142.1)設(shè)計(jì)引物，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增HMW-GS Bx7OE基因啟動(dòng)子。根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)PLACE與PlantCARE，對(duì)功能區(qū)域進(jìn)行分析，結(jié)果表明

4、:Bx7OE啟動(dòng)子序列具有典型的TATA框和CAAT框，存在種子特異性啟動(dòng)子元件有6個(gè)E-box、4個(gè)G-box、7個(gè)RY基序、6個(gè)B-box核心序列元件。整個(gè)序列中A+T占62.29％＞60％，為富含AT區(qū)，作為一般增強(qiáng)子起作用。其中還存在多個(gè)光響應(yīng)元件、分生組織特異激活元件、胚乳特異表達(dá)調(diào)控元件等共49個(gè)特異性作用元件。在Wild Cat中克隆的超表達(dá)HMW-GS Bx7OE啟動(dòng)子比在揚(yáng)麥158、中優(yōu)16中克隆的Bx7啟動(dòng)子在-10

5、90-1047之間多出43bp的核苷酸序列，功能分析得知其上有一個(gè)CAAT-box，它是增強(qiáng)子響應(yīng)元件。
　　 對(duì)啟動(dòng)子進(jìn)行改造構(gòu)建人工啟動(dòng)子，改造后包括截短的HMW-GS Bx7OE基因啟動(dòng)子核心區(qū)域和水稻actin基因的第一個(gè)內(nèi)含子，并在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)進(jìn)行了改良。根據(jù)有關(guān)報(bào)道貯藏蛋白基因沒(méi)有內(nèi)含子，在啟動(dòng)子區(qū)域增加一個(gè)內(nèi)含子能提高基因的表達(dá)水平，Joshi等研究表明在PCR擴(kuò)增actin的3'末端增加7個(gè)堿基GACCGCC有利

6、于提高轉(zhuǎn)錄效率。我們構(gòu)建了7個(gè)人工啟動(dòng)子，與Ubiquitin、Bx7OE啟動(dòng)子一起與GUS報(bào)告基因融合構(gòu)建9個(gè)瞬時(shí)表達(dá)載體，通過(guò)基因槍法分別導(dǎo)入小麥胚乳組織，以Ubiquitin啟動(dòng)子為對(duì)照，經(jīng)GUS染色檢測(cè)各啟動(dòng)子的活性，并通過(guò)GUS定量對(duì)啟動(dòng)子活性進(jìn)一步驗(yàn)證。結(jié)果表明:-1315-1區(qū)域包含HMW-GS Bx7OE啟動(dòng)子的全部活性，-1315-1區(qū)域與act1構(gòu)建的人工啟動(dòng)子比克隆的Bx7OE啟動(dòng)子（未改造）構(gòu)建載體的GUS活性高

7、3.3倍，比Ubiquitin構(gòu)建載體的GUS活性高5.6倍。
　　 在啟動(dòng)子改造的基礎(chǔ)上，選取HMW-GS Bx7OE的-1315-1的區(qū)域與actin基因的第一個(gè)內(nèi)含子構(gòu)建人工啟動(dòng)子，與本實(shí)驗(yàn)室具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的高賴氨酸蛋白基因Cflr（GenBank: EU367999）連接，以單子葉植物表達(dá)載體pAHC25為基礎(chǔ)，構(gòu)建pAHC25-Bx7OEp-act1-Cflr表達(dá)載體，通過(guò)基因槍法轉(zhuǎn)入小麥?zhǔn)荏w材料寧麥13、揚(yáng)麥16。