豬圓環(huán)病毒2型LAMP檢測方法建立和不同基因型感染性克隆的體外拯救.pdf

1、豬圓環(huán)病毒(Porcinecircovirus)是無囊膜單股負(fù)鏈環(huán)狀DNA病毒，于1974年首次從豬腎傳代細(xì)胞(PK15)中分離得到，根據(jù)致病性、抗原性和核酸序列的差異，分為PCV1和PCV2兩型。PCV1無致病性，PCV2是危害世界養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展，引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)、豬皮炎與腎病綜合征(PDNS)、仔豬先天性震顫(CT)、母豬繁殖障礙等多種疾病的重要病原之一。PCV2感染豬體后，侵害其免疫系統(tǒng)，使機體抵抗力下降而引起

2、繼發(fā)感染和混合感染，造成更嚴(yán)重的損失。
　　 本研究利用環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)（LAMP）建立了一種新的檢測PCV2核酸的方法，擴充了實驗室檢測抗原的方式，由于LAMP檢測方法擺脫了昂貴儀器的束縛，適合于條件受到限制的基層臨床診斷。此外，本研究根據(jù)PCV2型特異性基序Cap蛋白86-91位氨基酸序列，在對實驗室保存的菌株進行篩選，得到連有PCV2a和PCV2b兩型毒株的質(zhì)粒，酶切之后環(huán)化PCV全長，轉(zhuǎn)染PK15細(xì)胞，并成功拯救出兩型

3、病毒。得到可用的感染性克隆后，便可以改造基因序列從而改變決定分型的6個氨基酸殘基，為以后開展的型特異性序列與病毒致病力的關(guān)系研究打下了堅實基礎(chǔ)。
　　 以PCV2ORF2序列作為靶基因，用PrimerExplorerV4設(shè)計出4條LAMP引物。通過對體系各組分的優(yōu)化建立最佳體系，確定63℃為最適反應(yīng)溫度，1h以內(nèi)就能完成對核酸的擴增。制備出梯度質(zhì)粒模板，與PCR方法在靈敏度試驗中進行比較。LAMP方法最小檢出量達(dá)到接近1拷貝，敏

4、感性是之前實驗室所用PCR方法的一萬倍。并且，相同條件下，與PCV1、PRV或PPV的DNA均無交叉反應(yīng)現(xiàn)象。在臨床病料檢測中同樣有著良好的表現(xiàn)。在結(jié)果判定方面，LAMP不光可借助瓊脂糖凝膠電泳呈現(xiàn)出特有的階梯狀條帶，也可以向擴增產(chǎn)物中添加SYBRGreenⅠ核酸染料，通過肉眼觀察顏色變化。綜上，LAMP在對PCV2抗原檢測中，不論是檢測時間、條件要求、靈敏度都要優(yōu)于PCR方法。
　　 對實驗室保存的、之前測序過的、連有PCV2

5、DNA全長的重組質(zhì)粒的菌種進行篩選，PCV2Cap蛋白86-91位氨基酸序列若為TNKISI分屬PCV2a型，若為SNPRSV則為PCV2b型。搖菌再送測序，確定選擇D1株(HM142897)為PCV2a代表，SD1株(DQ346683)為PCV2b代表。PCV2基因序列中有唯一的SacⅡ酶切位點，當(dāng)時擴增PCV2全長的上下游引物便設(shè)立在此。因此以SacⅡ酶切重組質(zhì)粒pMD18-T-D1和pMD18-T-SD1，先得到PCV2a和PCV