轉(zhuǎn)基因水稻中表達(dá)胰島素樣生長因子IGF-I及其結(jié)合蛋白IGFBP-3的研究.pdf

1、胰島素樣生長因子(Insulin-like Growth Factors，簡稱IGFs)是一類與人類胰島素結(jié)構(gòu)和功能相似的多功能細(xì)胞增殖調(diào)控因子。在細(xì)胞的分化、增殖、個體的生長發(fā)育中具有重要的促進(jìn)作用。IGFs家族由兩種多肽(IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ)、兩類特異性受體及六種結(jié)合蛋白組成。IGF-Ⅰ是人體內(nèi)肝細(xì)胞、腎細(xì)胞、脾細(xì)胞等十幾種細(xì)胞自分泌和旁分泌的一種活性蛋白多肽物質(zhì)。研究表明，IGF-Ⅰ具有降血糖、降血脂、舒張血管、促進(jìn)骨的合成代

2、謝保持其正常結(jié)構(gòu)功能、促生長、促細(xì)胞分化、創(chuàng)傷修復(fù)的功能。在骨質(zhì)疏松癥、糖尿病、心血管疾病上具有預(yù)防和治療的作用。IGFBP-3(Insulin-like growth factor binding protein 3)作為IGFBPs家族成員之一，可通過IGF-Ⅰ依賴及非IGF-Ⅰ依賴方式調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡。最近的研究發(fā)現(xiàn)IGFBP-3與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，具有促凋亡、抑制細(xì)胞生長、增強(qiáng)癌細(xì)胞的放射敏感性等作用，IGFBP-3已成

3、為抗腫瘤治療的一個新靶點(diǎn)。因此本研究通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)，將IGF-Ⅰ基因和IGFBP-3基因?qū)胨局?，以期以水稻作為生物反?yīng)器大量生產(chǎn)該蛋白。
　　 本研究以人源IGF-Ⅰ基因和IGFBP-3基因序列為基礎(chǔ)進(jìn)行修飾，然后人工合成該基因。首先在其兩端分別加上蛋白標(biāo)簽(FLAG)，F(xiàn)LAG蛋白標(biāo)簽是一個與重組蛋白相融合的由8個親水氨基酸組成的多肽片斷，具有與特異性單抗結(jié)合的位點(diǎn)，以便以后對其蛋白提純。其次加上內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留序列(KDEL)

4、，可以避免其在植物細(xì)胞內(nèi)的降解。最后加上過表達(dá)水稻種子貯藏蛋白基因Glu-2(Gt1)，使IGF-Ⅰ和IGFBP-3基因可以在水稻種子中特異表達(dá)。將改造好的基因連接到構(gòu)建好的植物表達(dá)超雙元載體上，利用凍融法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌菌株EHA105中，侵染水稻種子，經(jīng)潮霉素篩選，最終獲得再生植株。再生植株經(jīng)潮霉素、PCR檢測，獲得了的轉(zhuǎn)基因植株。再對其轉(zhuǎn)基因植株的幼穗提取RNA進(jìn)行RT-PCR分析，證明大多數(shù)植株均轉(zhuǎn)錄所需的目的基因IGF-Ⅰ和IGFB