雜交稻親本SSR指紋圖譜構(gòu)建及兩系雜交稻和大青棵鑒定的研究.pdf

1、種子的真實性和純度是種子質(zhì)量檢驗的最主要的質(zhì)量指標之一。植物新品種特異性(Distinctness)、一致性(Uniformity)和穩(wěn)定性(Stability)的測試(簡稱DUS測試)是農(nóng)業(yè)部植物新品種保護辦公室對申請品種授予新品種權(quán)進行實質(zhì)審查最重要的工作內(nèi)容。水稻是我國主要的糧食作物，雜交稻具有雜種優(yōu)勢，產(chǎn)量高，抗性好，其種植面積已占我國水稻面積的一半。我國是世界上最大雜交水稻種子生產(chǎn)國和消費國，申請水稻新品種保護的品種數(shù)量在逐年

2、增加，是我國目前品種權(quán)申請保護的主要對象之一。然而，目前種子的真實性和純度檢測和植物新品種DUS測試均是田間種植方法鑒定。該方法周期長，費工占地，用于測試的標記性狀有限，不能滿足種子市場銷售，新品種及時授權(quán)的需要，研究快速、簡便、準確的DNA分子標記技術(shù)鑒定水稻品種對于雜交水稻種子質(zhì)量檢測和新品種授權(quán)具有重要意義。為運用SSR分子標記快速、準確鑒定江蘇省地區(qū)范圍內(nèi)生產(chǎn)上的雜交水稻種子的真實性和純度，需要考慮以下幾個重點問題：快速、高效的

3、DNA提取方法是分子標記鑒定品種的頸瓶技術(shù)，傳統(tǒng)的DNA提取方法技術(shù)難度大、操作步驟繁瑣，是分子標記品種鑒定技術(shù)不能普及的主要問題之一；兩系雜交稻母本的不育性易受光照時間和溫度的影響，兩系雜交稻會因不同年份或地區(qū)光、溫條件的變化導(dǎo)致母本自交結(jié)實而嚴重影響種子純度，但在海南的種植鑒定中，不育系有時表現(xiàn)可育，給形態(tài)鑒定帶來一定的困難；長江中下游地區(qū)是秈、粳雜交稻和常規(guī)稻均有種植的地區(qū)，在該地區(qū)的雜交稻制種田中經(jīng)常出現(xiàn)秈稻不育系與粳稻父本或粳

4、稻不育系與秈稻父本雜交的一種秈粳亞種雜交組合“大青棵”，這種雜株植株高大，抽穗期晚，雜交稻中大青棵是嚴重影響企業(yè)形象和產(chǎn)量的雜株類型，但海南種植鑒定時，大青棵受光溫影響不一定表現(xiàn)植株高大、抽穗期晚等特征，因此難以準確鑒別。為此，本論文擬從以下4個方面開展研究：一是改進DNA提取方法和步驟，研究快速、高效，并獲得高質(zhì)量的DNA提取方法。二是對生產(chǎn)上推廣的4個兩系雜交稻和1雜交粳稻的7親本進行多態(tài)性分析，并應(yīng)用SSR多態(tài)性標記鑒定兩系雜交組

5、合。三是建立近幾年來生產(chǎn)上常用的33份秈粳雜交稻親本DNA指紋數(shù)據(jù)庫，并對這些親本進行遺傳相似性分析，為雜交稻種子純度鑒定提供依據(jù)。四是選用了該地區(qū)的常用秈粳不育系與粳秈父本配制了55個秈粳亞種間雜交組合，考察了F1代株高、抽穗期和結(jié)實率等主要農(nóng)藝性狀，篩選用于鑒定本試驗所配制的秈粳雜交大青棵組合類型雜株的SSR分子標記，為該地區(qū)雜交稻中可能出現(xiàn)的大青棵的鑒定提供了依據(jù)。獲得的主要結(jié)果如下：
　　 1.改進了DNA提取方法。本研

6、究應(yīng)用了常規(guī)方法的DNA提取方法，同時也研究應(yīng)用了改進了DNA提取方法。在改進的DNA提取方法中，無需使用液氮，而將幼苗葉片放在真空冷凍干燥儀冷凍干燥2～3天，每個試管里盛放一小鋼珠球，使用研磨儀粉碎葉片組織。由于樣品分別在單獨的試管里進行研磨，避免了交叉污染。在試驗過程中，使用96孔聯(lián)體試管板，而不是單個離心試管，使用排槍代替單槍操作，CTAB方法提取DNA。通過多次試驗比較，這種方法是一種快速、高效并獲得高質(zhì)量的DNA的提取方法。按

7、照該方法操作，每人每天可提取上千個DNA樣品。
　　 2.通過4對SSR引物組合可以鑒定兩優(yōu)培九、兩優(yōu)108、培矮64S/E32和兩優(yōu)1224個生產(chǎn)上常用兩系雜交稻。
　　 選用52對SSR引物對以培矮64S為母本的4個兩系雜交稻組合的5個親本DNA多態(tài)性進行了分析，并以1個雜交粳稻86優(yōu)8號作為對照。結(jié)果表明：46對引物能在7個親本間擴增出多態(tài)性條帶。8對引物能將4個兩系雜交稻與對照雜交粳稻區(qū)分開且在86優(yōu)8號的親本中

8、具有多態(tài)性，可區(qū)分兩優(yōu)培九、兩優(yōu)108、培矮64S/E32、兩優(yōu)122和86優(yōu)8號F1及其親本的SSR引物分別為34、32、31、30和14對，有16對SSR引物均可用于區(qū)分4個兩系雜交組合F1和親本，RM206和RM286引物可區(qū)分本試驗的5個組合和各自的親本。應(yīng)用其中一對引物RM505對兩優(yōu)培九進行鑒定驗證，結(jié)果表明該引物能準確區(qū)分兩優(yōu)培九及其親本。根據(jù)本試驗中引物的多態(tài)性和特異性的結(jié)果，有多種途徑可鑒別這4個兩系雜交組合?？赏ㄟ^R

9、M13(或RM206、RM286等)、RM224(或RM337)、RM234(或RM252、RM505和RM565)和RM25(或RM217、RM248和RM585)等4對引物將兩優(yōu)培九、兩優(yōu)108、培矮64S/E32和兩優(yōu)122分別加以鑒別。
　　 3.建立了33個秈、粳雜交稻親本的SSR指紋圖譜數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)了6對可以用于鑒定秈、粳類型的SSR特征標記。
　　 選用分布在12條染色體上的84對SSR引物對5個粳型核質(zhì)互

10、作雄性不育系、4個秈型核質(zhì)互作雄性不育系和1個溫敏雄性不育系、14個秈型父本和9個粳型父本共33份材料進行遺傳相似性分析，并建立SSR指紋圖譜數(shù)據(jù)庫。結(jié)果表明：在33份親本中能夠擴增出多態(tài)性的引物為54對，占所用引物的64.3％。33份親本間的遺傳相似系數(shù)變異范圍為0.40～0.99。在遺傳相似系數(shù)0.66處，33份親本被聚為3個類群，培矮64S和岡46A為第Ⅰ類群，17個秈稻親本為第Ⅱ類群，14個粳稻親本為第Ⅲ類群。在秈、粳亞種內(nèi)，不

11、育系和可育品種又分為不同的亞群，基于SSR分子標記的聚類分析結(jié)果與與育種家提供的秈粳分類信息基本一致，進一步表明SSR指紋圖譜可以用于鑒定品種。利用18對引物能將33份親本區(qū)分開，RM264能將Ⅱ-32A、協(xié)青早A、岡46A和K17A4個秈型不育系與秈型可育品種區(qū)別開，RM432能將5個粳型不育系與粳型可育品種區(qū)別開。6對引物RM6、RM13、RM16、RM240、RM247和RM248均為鑒別秈、粳亞種類型的特異引物，利用這6個標記可

12、以鑒別秈型不育系串入粳稻花粉或粳型不育系串入秈稻花粉所產(chǎn)生的秈粳雜株類型。
　　 4.發(fā)現(xiàn)了可以用于本研究大青棵鑒定的SSR分子標記。有6對引物均可用于以六千辛A為母本的大青棵的鑒定，RM9或RM218可用于以Ⅱ-32A為母本的大青棵的鑒定，RM50和RM11等2個引物組合可用于以9522A為母本的大青棵的鑒定。
　　 研究了55個秈稻不育系與粳稻父本、粳稻不育系與秈稻父本雜交組合的主要農(nóng)藝性狀及其SSR分子標記特征，以

13、具備株高135cm以上、抽穗期121天以上特征的組合作為大青棵類型。結(jié)果表明：38個粳型不育系與秈稻父本的雜交后代中，以9522A為母本的雜交組合中只有9522A/紫尖秈-1是大青棵組合，以六千辛A為母本的8個組合均為大青棵組合；17個秈型不育系和粳稻父本的雜交后代中，以Ⅱ-32A為母本的雜交組合中，僅有Ⅱ-32A/C57，其余秈稻不育系為母本與粳稻父本的雜交組合均不是大青棵。與雜交F1代株高顯著相關(guān)的標記的引物有RM9、RM283、R

14、M429、RM515和RM483，其中RM9、RM283、RM429和RM515的標記與株高極顯著相關(guān)；與抽穗期顯著相關(guān)的標記的引物有RM9、RM44、RM206、RM152、RM276、RM228、RM515、RM211、RM432、RM454，其中RM9、RM44、RM206、RM152、RM515、RM211、RM432、RM454的標記與抽穗期極顯著相關(guān)。根據(jù)是否同時具備秈型和粳型特異性標記來鑒定是否是秈粳亞種間雜交組合。在以9

15、522A為母本的雜交組合中，大青棵可以通過RM50和RM11(或RM25、RM152、RM228、RM251、RM252、RM286、RM302、RM415)2個引物組合加以鑒定。以Ⅱ-32A為母本的4個組合中，Ⅱ-32A/C57大青棵可以通過RM9或RM218加以鑒定。因本研究中以六千辛A為母本所配制的組合均是大青棵，可以通過RM9、RM152、RM279、RM413、RM415和RM4296對引物中的任一個與其他粳稻不育系為母本的組