日本沼蝦含硒谷胱甘肽過(guò)氧化物酶全長(zhǎng)克隆及表達(dá)分析.pdf

1、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase，GPx)是生物體內(nèi)普遍存在的一種重要的抗氧化酶，可以及時(shí)清除體內(nèi)過(guò)量的活性氧分子(Reactive oxygenspecies，ROS)，在生物體自身抗氧化和損傷修復(fù)中發(fā)揮重要的作用，同時(shí)在生物體對(duì)抗外界病原體入侵的自身免疫過(guò)程中也起到關(guān)鍵的作用；根據(jù)含硒與否，GPx可以分為含硒谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(Se-GPx)和不含硒谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(non-Se-GPx)，鑒于GP

2、x在生物體生存和免疫過(guò)程中發(fā)揮的重要作用，我們以重要的淡水經(jīng)濟(jì)蝦類-日本沼蝦為研究材料，克隆了Se-GPx基因全長(zhǎng)序列，并對(duì)其表達(dá)情況進(jìn)行了分析。
　　實(shí)驗(yàn)所用日本沼蝦(體長(zhǎng)4.5±0.5 cm)捕撈于原陽(yáng)黃寺漁場(chǎng)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中取其肝胰腺、大顎器官、血細(xì)胞、肌肉、表皮以及卵巢等組織，提取各組織中的總RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，采用RACE方法從日本沼蝦肝胰腺中克隆得到Se-GPx基因全長(zhǎng)序列，并且對(duì)該序列結(jié)構(gòu)進(jìn)行了深入分析，研究了Se-GP

3、x基因在同本沼蝦各個(gè)組織中的分布情況，利用熒光實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)日本沼蝦血細(xì)胞中Se-GPx基因在蛻皮周期中以及注射嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)后的表達(dá)情況進(jìn)行了檢測(cè)以及分析。
　　采用RACE法克隆出的日本沼蝦Se-GPx基因cDNA為908bp，5’-UTR的長(zhǎng)度為91bp，3’-UTR長(zhǎng)為256bp，包括1個(gè)保守的硒代半胱氨酸插入序列(SECIS)和1個(gè)polyA尾巴，開(kāi)放閱讀框(ORF)長(zhǎng)度為56

4、1bp，編碼由186個(gè)氨基酸組成的多肽，分子質(zhì)量約21.2 kDa，理論等電點(diǎn)為6.74。日本沼蝦Se-GPX的第39個(gè)氨基酸為硒代半胱氨酸(Sec)，由終止密碼子TGA編碼；序列比對(duì)結(jié)果表明日本沼蝦Se-GPx在甲殼動(dòng)物中同羅氏沼蝦(Macrobrachium rosenbergi)的相似度最高，為90.34％；同脊椎動(dòng)物中的GPxl和GPx2家族相似性較高。
　　組織半定量結(jié)果顯示，日本沼蝦Se-GPx基因mRNA在血淋巴、肝

5、胰腺、肌肉、表皮、卵巢以及大顎器官中都有表達(dá)，在肝胰腺、卵巢和血淋巴中表達(dá)量相對(duì)較高，熒光實(shí)時(shí)定量結(jié)果顯示，Se-GPx基因在日本沼蝦蛻皮周期中的蛻皮前期表達(dá)量最高，而在蛻皮間期的表達(dá)量最低；利用嗜水氣單胞菌對(duì)日本沼蝦進(jìn)行刺激，發(fā)現(xiàn)在注射后的3 h和6 h，血細(xì)胞中Se-GPx基因表達(dá)量發(fā)生了顯著升高(P<0.05)。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Se-GPx在日本沼蝦蛻皮周期中發(fā)揮重要的作用，同時(shí)在日本沼蝦抵御外界病原體入侵過(guò)程中起到十分