玉米C4途徑關(guān)鍵酶基因(PPDK、NADP-ME)的克隆及PPDK、PEPC在擬南芥中的表達(dá)分析.pdf

1、光合作用是植物生物學(xué)產(chǎn)量的源泉，通過基因工程手段人為加強(qiáng)“C4特性”在C3遺傳背景下的發(fā)揮，實(shí)現(xiàn)C3植物光合途徑的C4化，對(duì)于提高作物光能利用率和產(chǎn)量具有重要意義。本試驗(yàn)從酶活和光合均高的玉米自交系中克隆了玉米C4型丙酮酸磷酸二激酶(PPDK)和依賴于NADP的蘋果酸酶(NADP-ME)基因，并利用PPDK和本實(shí)驗(yàn)室先前克隆的PEPC基因(GeneBank：FJ415327)轉(zhuǎn)化擬南芥，研究了這兩個(gè)基因的單獨(dú)及協(xié)同作用，通過其生理生化方

2、面的變化，為C3作物光合效率的改善提供了候選基因，為C4途徑關(guān)鍵酶導(dǎo)入小麥等C3作物提供了依據(jù)。
　　 主要結(jié)論如下：
　　 1.利用同源克隆技術(shù)，從玉米中克隆了PPDKI(GenBank：GU363532)和NADP-ME基因的cDNA，并插入雙元表達(dá)載體pCAMBIA3301、pCAMBIA1391中，構(gòu)建了p3301-PPDK、p3301-ME和p1391-ME融合表達(dá)載體。序列測(cè)定結(jié)果表明，PPDK基因長(zhǎng)度為30

3、04Bp，包含一個(gè)起始密碼子和971個(gè)氨基酸的開放閱讀框，與已登陸的玉米PPDK基因(GeneBank：BT054438)相比，氨基酸序列同源性可達(dá)99.4％；NADP-ME基因長(zhǎng)度為2127Bp，包含一個(gè)起始密碼子和636個(gè)氨基酸的開放閱讀框，與已登陸的玉米NADP-ME基因(GenBank：NM＿001111843.1)相比，氨基酸序列同源性可達(dá)99.6％。
　　 2.Southernblot表明玉米PPDK、PEPC基因已

4、整合到擬南芥基因組中，擬南芥轉(zhuǎn)化率為0.69％，雙基因共轉(zhuǎn)化率為0.07％，66.7％的雙基因擬南芥符合Mendel單基因的遺傳規(guī)律。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將p3301-PPDK和本實(shí)驗(yàn)室曾構(gòu)建的p3301-PEPC高效表達(dá)載體導(dǎo)入擬南芥中，篩選到327株抗性轉(zhuǎn)基因擬南芥，其中PEPC株系125株，PPDK株系175株，PPDK、PEPC共表達(dá)株系12株，轉(zhuǎn)p3301株系15株，篩選到PPDK、PEPC、PPDK+PEPC、p3301純系各2

5、4、26、8、3個(gè)。
　　 3.RT-PCR、熒光定量PCR、Westernblot分析表明外源基因在擬南芥基因組中得到正確表達(dá)，且轉(zhuǎn)PPDK、PEPC基因植株的表達(dá)量存在較大差異。熒光定量PCR分析現(xiàn)蕾期PPDK、PEPC基因的相對(duì)表達(dá)量分別在1.0-4.2倍和1.0-13.3倍；用QuantityOne軟件對(duì)Westernblot進(jìn)行定量分析表明，PPDK、PEPC基因的蛋白相對(duì)表達(dá)量分別在1.9-2.5倍和1.6-3.7倍

6、。
　　 4.轉(zhuǎn)單、雙C4關(guān)鍵酶基因均可以提高擬南芥光合速率，雙基因的平均光合速率高于轉(zhuǎn)PEPC基因的平均光合速率，轉(zhuǎn)PEPC基因的平均光合速率高于轉(zhuǎn)PPDK基因的平均光合速率。T3代轉(zhuǎn)基因擬南芥酶活和光合速率測(cè)定表明：T3代轉(zhuǎn)基因擬南芥PPDK、PEPC酶活分別比對(duì)照增加0.61-3.63倍和0.77-4.81倍，平均增加1.89和1.48倍；轉(zhuǎn)PPDK基因擬南芥光合速率增加3.3-25.3％，平均增加12.2％，轉(zhuǎn)PEPC基

7、因擬南芥光合速率增加6.5-35.1％，平均增加18.9％，雙基因(PPDK+PEPC)擬南芥光合速率增加12.6-45.7％，平均增加26.3％。
　　 5.轉(zhuǎn)單個(gè)C4關(guān)鍵酶基因加速了C4微循環(huán)。T4代轉(zhuǎn)基因擬南芥酶活測(cè)定表明：PK17-1-2、PK26-3-2的PEPC酶活分別比對(duì)照增加18.65％和46.37％，與對(duì)照差異極顯著；PC65-4-6、PC73-1-13的PPDK酶活分別比對(duì)照增加12.96％和26.54％，與

8、對(duì)照差異極顯著，說(shuō)明轉(zhuǎn)PPDK基因擬南芥可引起PEPC活性增加，反之亦然；T4代轉(zhuǎn)基因擬南芥光合測(cè)定表明：PK17-1-2、PK26-3-2、PC65-4-6、PC73-1-3的光合速率分別比對(duì)照增加了13.14％、23.29％、18.14％、36.44％，達(dá)極顯著水平。
　　 6.PPDK、PEPC共表達(dá)有協(xié)同效應(yīng)。雙基因株系PKC6-5-1的光合速率比PK26-3-2和PC73-1-3的高，但是PKC6-5-1的PEPC酶活