小麥籽粒淀粉生物合成及淀粉分支酶基因(SBE-Ⅱb)的克隆與表達(dá).pdf

1、小麥在我國是僅次于水稻的第二大重要的糧食作物，其產(chǎn)量與品質(zhì)是直接關(guān)系著人類食物的供應(yīng)程度和營養(yǎng)水平。小麥籽粒的主要成分是淀粉，淀粉是以碳水化合物的形式儲(chǔ)存的，人類80％左右的能量都是由淀粉提供；淀粉除作為食品外，在工業(yè)方面作為原材料的應(yīng)用更加廣泛：造紙、紡織、能源、化工、制藥、機(jī)械、建筑等行業(yè)對(duì)淀粉的需求潛力很大，若小麥育種能夠向?qū)I(yè)化發(fā)展，那么不同的行業(yè)對(duì)淀粉的需求必將會(huì)再上一個(gè)臺(tái)階。因此深入研究小麥籽粒淀粉的生物合成，為以后利用生物

2、技術(shù)來提高淀粉的產(chǎn)量及改良其品質(zhì)奠定基礎(chǔ)，對(duì)選育淀粉以及品質(zhì)專用型的小麥具有重要意義。為此，本研究選用不同基因型的兩個(gè)高淀粉和兩個(gè)低淀粉含量的六倍體小麥為材料，對(duì)高、低淀粉含量的小麥品種籽粒灌漿過程中淀粉含量積累的動(dòng)態(tài)變化、淀粉合成關(guān)鍵酶活性的動(dòng)態(tài)變化、淀粉合成關(guān)鍵酶基因表達(dá)差異、同時(shí)對(duì)酶活性的動(dòng)態(tài)變化與淀粉積累動(dòng)態(tài)以及酶基因表達(dá)差異之間存在的關(guān)系進(jìn)行了相關(guān)性分析。并且通過反轉(zhuǎn)錄的方法克隆得到了高淀粉小麥籽粒胚乳的SBEⅡb的cDNA，

3、并構(gòu)建了蛋白表達(dá)載體，在大腸桿菌中誘導(dǎo)進(jìn)行過量表達(dá)并對(duì)其表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化，還分別構(gòu)建了SBEⅡb基因的超量表達(dá)載體和SBEⅡb基因的RNAi干擾表達(dá)載體，并在模式植物中系統(tǒng)的分析了它們的分子特征、表達(dá)特性和功能活性等。主要結(jié)果如下：
　　1、小麥籽粒灌漿過程中總淀粉及淀粉組分的積累動(dòng)態(tài)變化，結(jié)果表明高淀粉含量的品種和低淀粉含量的品種在籽粒淀粉積累量和積累速率上均存在明顯的基因型差異。Logistic方程擬合淀粉積累過程發(fā)現(xiàn)，支、

4、直鏈淀粉最終積累量取決于積累啟動(dòng)時(shí)間的早晚和積累速率的大小，而最大積累速率出現(xiàn)時(shí)間的早晚對(duì)其調(diào)節(jié)作用較小。
　　2、小麥籽粒灌漿過程中不同類型籽粒中的GBSS、SSS、SBE和DBE酶活性變化均呈現(xiàn)單峰曲線，峰值出現(xiàn)在12-24d不等。4個(gè)品種的GBSS酶活性均與直鏈淀粉的積累速率呈極顯著正相關(guān)，與總淀粉的積累速率達(dá)到顯著或極顯著正相關(guān)，但與支鏈淀粉的積累速率的相關(guān)性不顯著。SBE和SSS酶活性與總淀粉的積累速率和支鏈淀粉的積累速

5、率呈顯著或極顯著正相關(guān)，而與直鏈淀粉積累速率的相關(guān)不顯著。DBE活性與淀粉積累速率的相關(guān)性不顯著，淀粉合成關(guān)鍵酶活性間的相關(guān)性分析表明高淀粉含量的品種DBE活性與SSS、GBSS和SBE達(dá)到顯著性或極顯著性水平，它們之間可能存在著協(xié)同作用。
　　3、采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法，對(duì)灌漿期籽粒淀粉合成酶相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行了檢測(cè)和比較，并對(duì)其表達(dá)量與相應(yīng)酶活性的相關(guān)性做了分析。結(jié)果表明，束縛態(tài)淀粉合成酶基因（GBSS）、可溶性

6、淀粉合成酶基因（SSS）、淀粉分支酶基因（SBE）、淀粉去分支酶（DBE）酶活性均呈單峰曲線變化,利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)9個(gè)基因在不同淀粉含量的4個(gè)供試品種花后不同時(shí)期的相對(duì)表達(dá)量,結(jié)果表明，在花后6d這些基因開始表達(dá)，在灌漿的中期花后12-18d不等有表達(dá)的小高峰，兩個(gè)高淀粉含量的品種在不同時(shí)期的酶活性及其酶基因的相對(duì)表達(dá)量均比兩個(gè)低淀粉含量的品種相對(duì)較高；這些基因表達(dá)譜與酶活性相關(guān)分析顯示，除GBSS外其它幾種淀粉合成酶基因

7、均與相應(yīng)酶活性呈顯著或極顯著正相關(guān)，而且GBSS酶活性到達(dá)峰值時(shí)間稍遲于DBE、SSS、SBE等酶，說明DBE、SSS、SBE基因可能主要通過轉(zhuǎn)錄水平來控制籽粒淀粉的合成，而GBSS基因可能主要通過轉(zhuǎn)錄后水平來控制籽粒淀粉的合成。
　　4、采用RT-PCR技術(shù)克隆了小麥胚乳基因SBEⅡb全長cDNA序列，同時(shí)構(gòu)建了原核生物表達(dá)載體pET28（a+）-SBEⅡb，對(duì)不同的IPTG誘導(dǎo)濃度和誘導(dǎo)時(shí)間等條件的優(yōu)化結(jié)果表明，37℃，8h能

8、誘導(dǎo)SBEⅡb融合蛋白的最大量表達(dá)，在0.5mmol/LIPTG濃度下可以成功表達(dá)出了SBEⅡb蛋白。為進(jìn)一步體外研究SBEⅡb的物理化學(xué)性質(zhì)及催化機(jī)理奠定基礎(chǔ)。
　　5、構(gòu)建SBEⅡb的RNAi表達(dá)載體，并對(duì)其轉(zhuǎn)化煙草，檢測(cè)其對(duì)直鏈淀粉合成的影響。以植物表達(dá)載體PZP35S為基礎(chǔ)，構(gòu)建了由組成型啟動(dòng)子35S調(diào)控的SBEⅡb基因的RNAi植物表達(dá)載體。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)其在轉(zhuǎn)基因煙草中的相對(duì)表達(dá)量，并測(cè)定轉(zhuǎn)基

9、因植株中直鏈淀粉的含量和支鏈淀粉含量的變化。結(jié)果表明：經(jīng)qRT-PCR證實(shí)SBEⅡb基因的表達(dá)量較對(duì)照下降，而且支鏈淀粉含量變化顯著，直鏈淀粉較對(duì)照有上升但變化沒有達(dá)到顯著水平。
　　6、構(gòu)建SBEⅡb基因的過量表達(dá)載體，將克隆得到的基因SBEⅡb構(gòu)建到了植物表達(dá)載體pPZP35S上，通過農(nóng)桿菌葉盤轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化煙草葉片，經(jīng)卡那霉素篩選、PCR擴(kuò)增鑒定證明，SBE-Ⅱb基因已成功轉(zhuǎn)入煙草細(xì)胞中，獲得4個(gè)轉(zhuǎn)基因植株。RT-PCR半定量和