中國(guó)部分地區(qū)馬流感病毒的分子流行病學(xué)調(diào)查和重組禽痘病毒載體疫苗的初步研究.pdf

1、馬流感(equine influenza,EI)是由正黏病毒科A型流感病毒屬引起的馬屬動(dòng)物的一種常見(jiàn)的病毒性呼吸系統(tǒng)疾病。眾所周知,A型流感病毒可以根據(jù)病毒粒子表面糖蛋白的差異劃分成不同的亞型(H1-H16,N1-N9),而感染馬屬動(dòng)物的流感病毒通常是H7N7亞型或H3N8亞型。雖然H7N7亞型的馬流感病毒在馬群內(nèi)已經(jīng)消失很久,但是疫苗接種并沒(méi)有有效地預(yù)防H3N8亞型馬流感病毒在世界范圍內(nèi)的蔓延。我國(guó)是一個(gè)養(yǎng)馬大國(guó),歷史上曾經(jīng)發(fā)生過(guò)多次

2、馬流感疫情,給我過(guò)的養(yǎng)馬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失；同時(shí),我國(guó)的賽馬業(yè)也正在逐步興起。因此,本論文的主要研究?jī)?nèi)容是研究我國(guó)目前馬流感病毒的遺傳演化規(guī)律,選擇適合在我國(guó)作為疫苗株應(yīng)用的馬流感病毒分離株,制備能夠有效預(yù)防馬流感疫情在我國(guó)蔓延的候選疫苗。
　　 2007年,我國(guó)新疆和田地區(qū)發(fā)生馬流感疫情,發(fā)病動(dòng)物除了馬外,大量地方品種的驢也被感染,發(fā)病率較高,死亡率較低。我們采集發(fā)病驢的鼻拭子樣品,進(jìn)行病毒的分離鑒定。結(jié)果表明,有一份鼻拭子

3、分離物能夠在9-10日齡的雞胚上進(jìn)行增殖,收集尿囊液能夠具有血凝效價(jià),傳代穩(wěn)定后效價(jià)能夠達(dá)到128價(jià),病毒EID50為107.5／ml。通過(guò)對(duì)濃縮的雞胚尿囊液以及病毒在細(xì)胞上傳代之后的切片進(jìn)行電鏡檢查,能夠看到病毒粒子呈多形性,具有流感病毒的典型特征。小鼠致病性試驗(yàn)表明,該病毒株對(duì)小鼠致病性較低,病毒感染后不能引起小鼠出現(xiàn)臨床癥狀和典型的病理變化。通過(guò)對(duì)該病毒株的全基因組各個(gè)節(jié)段的擴(kuò)增和聚類分析表明,該流感病毒的8個(gè)節(jié)段都與馬的流感病毒

4、處于同一簇,為典型的馬流感病毒。因此,本試驗(yàn)研究表明該病毒分離株為一株驢源的馬流感病毒。為了有效地預(yù)防馬流感疫情在我國(guó)的蔓延,我們除了加強(qiáng)對(duì)馬的流感疫情監(jiān)測(cè),還應(yīng)該加強(qiáng)對(duì)其他馬屬動(dòng)物,如驢等,的馬流感疫情的監(jiān)測(cè)。
　　 最近幾年來(lái),我國(guó)一直發(fā)生馬流感疫情。我國(guó)的周邊國(guó)家如印度、蒙古、日本也發(fā)生馬流感疫情。北美地區(qū)和歐洲及英國(guó)地區(qū)的馬流感病例也時(shí)有發(fā)生。為了研究我國(guó)馬流感病毒的遺傳變異情況,我們從全國(guó)主要的養(yǎng)馬地區(qū),采集疑似馬流感

5、癥狀的鼻拭子樣本,然后進(jìn)行病毒分離和RT-PCR驗(yàn)證。通過(guò)對(duì)馬流感病毒全基因組各個(gè)節(jié)段的序列比對(duì)和遺傳進(jìn)化分析表明,我國(guó)近年來(lái)分離的馬流感病毒為佛羅里達(dá)Ⅱ型的H3N8馬流感病毒,與蒙古分離株A／Mongolia／1／2008和印度分離株A／equine／Jammu-Katra／6／2008同源性較近,這些病毒都起源于歐洲近年來(lái)流行的佛羅里達(dá)Ⅱ型馬流感病毒,但與日本分離株在遺傳進(jìn)化樹上處于不同的進(jìn)化分支,同時(shí)與我國(guó)上世紀(jì)90年代分離的馬流

6、感病毒(歐洲型)也處于明顯不同的進(jìn)化分支。與其它分支的馬流感病毒相比,我國(guó)流行的馬流感病毒HA蛋白一些抗原位點(diǎn)上的關(guān)鍵氨基酸發(fā)生改變,有意思的是A／equine／Liaoning／9／2008由于165位氨基酸位點(diǎn)的改變使得該病毒在位置發(fā)生一處糖基化位點(diǎn)的缺失。以上結(jié)果表明,我國(guó)的馬流感疫情發(fā)生了新的遺傳演化情況,這需要我們進(jìn)一步加強(qiáng)我國(guó)的馬流感疫情監(jiān)測(cè)。
　　 近幾年來(lái),我國(guó)一直受到馬流感疫情的威脅。許多養(yǎng)馬地區(qū)并未接種馬流感

7、疫苗,并且我國(guó)也沒(méi)有自己的馬流感疫苗可用,馬流感疫苗還主要依賴進(jìn)口。鑒于此,本研究擬用禽痘病毒載體表達(dá)系統(tǒng)來(lái)進(jìn)行馬流感疫苗的研制,以希望能夠制備出適合在我國(guó)應(yīng)用的馬流感疫苗。首先我們構(gòu)建了分別表達(dá)歐洲系馬流感病毒A／equine／Qinghai／1／1994和美洲系馬流感病毒A／equine／Xinjiang／3／2007的保護(hù)性抗原基因HA基因的重組禽痘病毒載體,通過(guò)western-biot和IFA鑒定,我們所構(gòu)建的重組病毒能夠和馬流

8、感病毒特異性的陽(yáng)性血清發(fā)生反應(yīng),說(shuō)明我們構(gòu)建的重組病毒能夠正確地表達(dá)外源基因。這為進(jìn)一步研究該重組疫苗對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的保護(hù)效果奠定了基礎(chǔ)。
　　 為了進(jìn)一步驗(yàn)證該重組禽痘病毒載體疫苗的保護(hù)效果。本試驗(yàn)進(jìn)一步研究了重組禽痘病毒疫苗的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)情況。首先,我們將重組病毒分組免疫小鼠,疫苗免疫后進(jìn)行攻毒保護(hù)試驗(yàn),試驗(yàn)結(jié)果表明,本研究所構(gòu)建的兩個(gè)重組病毒均能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生針對(duì)病毒的抗體；攻毒后,重組病毒免疫組能夠保護(hù)小鼠抵抗流感病毒的攻擊,而