禽呼腸孤病毒誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的機(jī)制及其與病毒復(fù)制的關(guān)系.pdf

1、禽呼腸孤病毒(ARV)是家禽重要疾病之一，主要感染雞和火雞，常與其他疾病混合感染，并引起免疫抑制。雖然ARV感染已被證實(shí)可誘導(dǎo)宿主細(xì)胞凋亡，但ARV與其靶細(xì)胞之間的相互作用關(guān)系，需進(jìn)一步研究。
　　 為了探討ARV分離株GX/2010/1感染細(xì)胞后對(duì)自噬的影響，我們首先用表達(dá)GFP-LC3融合蛋白的重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染非洲綠猴腎細(xì)胞(Vero)和雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)，然后再感染ARV分離株GX/2010/1，利用熒光顯微鏡觀察G

2、FP-LC3在細(xì)胞內(nèi)形成的聚點(diǎn)。結(jié)果顯示，ARV感染組和雷帕霉素處理組發(fā)生聚點(diǎn)的細(xì)胞顯著多于對(duì)照組。進(jìn)一步采用透射電子顯微鏡對(duì)ARV感染的Vero細(xì)胞中形成的自噬泡進(jìn)行觀察。結(jié)果顯示，經(jīng)ARV感染的Vero細(xì)胞中可觀察到許多典型自噬結(jié)構(gòu)，比如杯狀體、腫脹的線粒體、自噬體雙層膜結(jié)構(gòu)等。
　　 因?yàn)長(zhǎng)C3Ⅱ表達(dá)量通常作為自噬發(fā)生水平的標(biāo)志，我們通過(guò)免疫印跡的方法檢測(cè)ARV分離株GX/2010/1感染Vero細(xì)胞和CEF細(xì)胞中LC3-

3、Ⅱ/β-Actin比值的變化，發(fā)現(xiàn)ARV感染組和雷帕霉素處理組LC3-Ⅱ/β-Actin比值均顯著升高，并在病毒感染早期促進(jìn)自噬，在病毒感染晚期則抑制自噬。進(jìn)一步檢測(cè)p-mTOR/β-Actin和p-Akt/β-Actin的比值，結(jié)果表明(Ⅰ)型PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路依賴于自噬發(fā)生。
　　 為了探討宿主細(xì)胞自噬對(duì)ARV分離株GX/2010/1復(fù)制的影響，我們對(duì)藥物誘導(dǎo)和抑制Vero細(xì)胞和CEF細(xì)胞自噬的條件進(jìn)行優(yōu)化，

4、結(jié)果顯示100nM雷帕霉素和50μM的氯喹可分別顯著誘導(dǎo)和抑制宿主細(xì)胞自噬。采用以上濃度預(yù)處理Vero和CEF細(xì)胞，然后感染病毒，TCID50法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液上清中子代病毒的滴度，發(fā)現(xiàn)自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素可提高ARV分離株GX/2010/1感染宿主細(xì)胞的病毒復(fù)制水平，而自噬抑制劑氯喹則通過(guò)抑制自噬溶酶體的形成，致使病毒滴度降低。表明細(xì)胞自噬對(duì)ARV復(fù)制具有促進(jìn)作用。
　　 總之，本研究證實(shí)了自噬決定ARV分離株GX/2010/1感