桑查爾酮合成酶基因的克隆表達(dá)及桑枝多酚類成分的表征分析.pdf

1、桑枝為桑科植物桑Morus alba L.的干燥嫩枝，是我國(guó)應(yīng)用歷史悠久的中藥。桑枝微苦，平，歸肝經(jīng)，具有去風(fēng)濕，利關(guān)節(jié)，行水氣的功效。主治風(fēng)寒濕痹，四肢拘攣，腳氣浮腫，肌體風(fēng)癢等癥。桑枝多酚類成分主要有綠原酸、蘆丁、紫云英苷等，不同種質(zhì)資源的桑枝成分上大體一致，但是含量有一定差異。本研究從黃酮類成分生物合成途徑的分子機(jī)制入手，研究桑CHS基因的表達(dá)與多酚類成分動(dòng)態(tài)積累，其結(jié)果如下:
　　1.桑枝化學(xué)成分動(dòng)態(tài)變化研究
　　本

2、研究選取了四川廣泛栽種的桑Morus alba L.的兩個(gè)栽培品種，即?？?1號(hào)和紅果2號(hào)，并且分別在每個(gè)居群選擇了8棵樣品樹(shù)，從2010年1月到2010年12月每月中旬采收當(dāng)年生長(zhǎng)的枝條（直徑約1cm），采用HPLC法建立兩個(gè)栽培品種1～12月的192批次樣品的指紋圖譜，進(jìn)行了相似度評(píng)價(jià)及含量動(dòng)態(tài)變化分析。得出了桑枝化學(xué)成分動(dòng)態(tài)積累的結(jié)果:
　　相同栽培品種、同一居群在相同采收對(duì)間下的的樣本，其化學(xué)成分組成及含量差異變化不大（相

3、似度均大于0.9，各樣品的總峰面積無(wú)顯著差異）;而在不同的采收時(shí)間的化學(xué)成分組成差異不大（相似度均大于0.9），但含量差異較大，如紅果2號(hào)最低總峰面積（5月）為最高總峰面積（11月）的11％，保坎61號(hào)最低總峰面積（6月）為最高總峰面積（1月）的5％。
　　兩個(gè)栽培品種在相同采收時(shí)間下，樣本的指紋圖譜相似，其化學(xué)成分組成相近（相似度均大于0.9），但化學(xué)成分含量差異較大，如8月時(shí)?？?1號(hào)的蘆丁含量?jī)H為紅果2號(hào)的52％;兩個(gè)栽培品

4、種在不同采收時(shí)間的化學(xué)成分總含量變化趨勢(shì)總體一致，1～2月呈下降趨勢(shì)，2～9月變化不明顯，10～12月呈上升趨勢(shì)。
　　2.CHS基因的克隆、相對(duì)表達(dá)與桑葉、桑枝化學(xué)成分含量變化相關(guān)性
　　本研究以樣品桑MA-1、MA-2作為研究對(duì)象，于每月中旬進(jìn)行采收，首次研究了CHS基因在桑葉中的克隆、相對(duì)表達(dá)，及其與桑葉、桑枝化學(xué)成分含量變化進(jìn)行相關(guān)性分析。得到如下結(jié)果:
　　通過(guò)克隆CHS基因，經(jīng)過(guò)測(cè)序并得到該基因片段，在Ge

5、nbank進(jìn)行同源性分析，首次發(fā)現(xiàn)了CHS基因在桑葉中的存在，證明了CHS基因在桑葉中有表達(dá)。
　　通過(guò)多次實(shí)驗(yàn)條件的篩選，建立了提取桑葉RNA的最優(yōu)提取方法為T(mén)rizol法及克隆CHS基因的最優(yōu)PCR條件:退火溫度:56℃，上游引物P15'-GTCCGAGACGAAGACGAG-3'、下游引物P25'-CTTGTACATCTCGGTGTA-3'。
　　通過(guò)實(shí)驗(yàn)條件的篩選及引物設(shè)計(jì)，建立了熒光定量PCR的方法與條件:退火溫度

6、:56℃，上游引物F15'-AACATGTCGAGTGCGTGTGT-3'、下游引物R15'-GTCTTGAGCCCATCTTCAGC-3'。
　　首次對(duì)CHS基因在桑葉中的表達(dá)水平進(jìn)行了研究分析，發(fā)現(xiàn)CHS基因在不同生長(zhǎng)發(fā)育期的桑葉中的相對(duì)表達(dá)量是有差異的。如MA-1樹(shù)CHS基因最低相對(duì)表達(dá)量（10月）為最高相對(duì)表達(dá)量（9月）的3％，MA-2樹(shù)CHS基因最低相對(duì)表達(dá)量（10月）為最高相對(duì)表達(dá)量（9月）的5％。
　　CHS基

7、因在桑葉中的相對(duì)表達(dá)量的變化趨勢(shì)基本一致，從4月開(kāi)始表達(dá)量逐漸減少，5月降低，到6月又升高，7～8月逐步降低，然而9月達(dá)到最高值，此時(shí)的表達(dá)量分別為1.29、1.47，隨之降低。
　　CHS基因在桑葉中的相對(duì)表達(dá)量與桑葉中化學(xué)成分的含量的相關(guān)性分析得出，二者呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)的范圍在0.457～0.862。這說(shuō)明CHS基因在桑葉中有效成分的合成起到一定的調(diào)控作用。從分子水平上為桑葉有效成分的研究奠定了基礎(chǔ)，也為分子機(jī)制方面研究中藥

8、品質(zhì)提供了一定的依據(jù)。但是CHS基因在桑葉中的相對(duì)表達(dá)量與桑枝中化學(xué)成分的含量的相關(guān)性分析得出二者無(wú)顯著關(guān)聯(lián)。
　　本研究揭示了遺傳、產(chǎn)地環(huán)境等因素在中藥品質(zhì)形成過(guò)程中的影響，為今后從分子水平上研究中藥品質(zhì)的形成提供了依據(jù)。同時(shí)，在未來(lái)的研究中，應(yīng)考慮內(nèi)因與外因兩方面的因素對(duì)中藥品質(zhì)的影響。在內(nèi)因方面，主要考慮到關(guān)鍵酶基因的結(jié)構(gòu)、功能以及酶的突變等問(wèn)題;在外因方面，主要考慮到產(chǎn)地、氣候、土壤、栽培技術(shù)、病蟲(chóng)害防治、采收時(shí)間等方面的