普通煙草脯氨酸合成酶基因NtP5CS和Ntδ-OAT的克隆與表達(dá)分析.pdf

1、煙草種植多分布在水利條件不好的山區(qū)或半山區(qū),干旱是限制我國煙葉產(chǎn)量和品質(zhì)進(jìn)一步提高的重要因子。研究煙草水分脅迫響應(yīng)的相關(guān)基因并進(jìn)行克隆和表達(dá)分析,對揭示煙草的抗旱分子機(jī)制和改良煙草的抗旱性具有重要意義。本研究從普通煙草中分離脯氨酸合成關(guān)鍵酶基因的全長cDNA序列,分析該基因的序列特征、進(jìn)化關(guān)系和不同逆境脅迫誘導(dǎo)下的表達(dá)模式,揭示其對脅迫誘導(dǎo)的應(yīng)答機(jī)制,為利用該基因改良普通煙草的抗逆境脅迫能力提供理論指導(dǎo)。本論文主要包括以下兩方面的內(nèi)容:

2、
　　 1、本研究利用已知基因同源片段設(shè)計簡并引物獲得P5CS基因中間片段,利用RACE技術(shù)擴(kuò)增其全長cDNA；采用生物信息學(xué)技術(shù)分析該基因的序列結(jié)構(gòu)及其編碼蛋白的保守域及基本特性;利用RT-PCR研究其表達(dá)模式。從受干旱脅迫誘導(dǎo)的普通煙草品種中煙14中克隆到全長為2584 bp的煙草P5CS基因,命名為NtP5CS,GenBank登錄號為HM854026,開放讀碼框為2160 bp,編碼719個氨基酸。經(jīng)Blast同源性比對分

3、析,該序列與番茄tomPRO2基因在核苷酸和氨基酸水平上高度同源。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示,NtP5CS與番茄tomPRO2基因可能是直系同源基因。RT-PCR分析表明,干旱、低溫、ABA、高鹽等脅迫條件均可誘導(dǎo)NtPSCS基因的上調(diào)表達(dá),且在旺長期和脅迫條件下根和葉中表達(dá)量最高。首次從普通煙草中克隆得到PSCS基因,該基因?qū)λ置{迫響應(yīng),可能參與普通煙草抗?jié)B透脅迫反應(yīng)。
　　 2、鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶是以鳥氨酸為前體合成脯氨酸的關(guān)鍵酶,對植

4、物適應(yīng)逆境脅迫起關(guān)鍵作用。本研究根據(jù)其已知保守序列設(shè)計簡并引物,從普通煙草品種中煙14中克隆到一條425bp的中間片段,應(yīng)用RACE方法設(shè)計特異性引物擴(kuò)增得到5'末端和3’末端cDNA序列,經(jīng)BLAST驗證,首次從普通煙草中克隆到了鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因,命名為Ntδ-OAT,其GenBank登錄號為GU144571。該基因cDNA全長為1781bp,共編碼477個氨基酸。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示,Ntδ-OAT基因的進(jìn)化符合傳統(tǒng)的生物學(xué)分類,主要