球孢白僵菌兩種甘露醇脫氫酶及五種過氧化氫酶的功能分析與對鱗翅目幼蟲高口服毒力的工程菌株構(gòu)建.pdf

1、球孢白僵菌已被開發(fā)成多種制劑應(yīng)用于農(nóng)林害蟲的防治，但其田間防治效果受環(huán)境因子的制約，這是制約真菌殺蟲劑大規(guī)模應(yīng)用推廣的技術(shù)瓶頸和亟待解決的國際難題。開展白僵菌抗逆生物學(xué)研究，揭示抗逆性狀的分子基礎(chǔ)，定向遺傳改良生產(chǎn)菌株的抗逆力和毒力，是提升生防真菌制劑質(zhì)量和田間應(yīng)用穩(wěn)定性的核心技術(shù)途徑。
　　 甘露醇是生物體內(nèi)廣泛存在的小分子多元醇，作為碳源儲備物，也參與真菌的抗逆境脅迫生理反應(yīng)。過氧化氫酶是細(xì)胞抗氧化酶系的重要成員，在細(xì)胞抵抗

2、活性氧自由基(ROS)脅迫過程中發(fā)揮著重要的作用。目前在生防真菌中有關(guān)甘露醇代謝相關(guān)酶系的生物學(xué)功能知之有限，對過氧化氫酶在抗逆反應(yīng)中的作用也鮮有研究報道。另外，將外源蘇云金芽孢桿菌(簡稱Bt)營養(yǎng)期殺蟲蛋白Vip3Aa1基因置于構(gòu)巢曲霉組成型通用啟動子Pgpd4下導(dǎo)入球孢白僵菌中能有效提高工程菌株對斜紋夜蛾低齡幼蟲的毒力，但受啟動子驅(qū)動力的影響，Vip3Aa1毒蛋白的表達(dá)量不足以致死高齡的葉面暴食性害蟲。為此，本論文從揭示球孢白僵菌抗

3、逆生物學(xué)機理及提高菌株口服毒力的角度出發(fā)，運用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的同源重組以及芽生孢子化學(xué)轉(zhuǎn)化法，系統(tǒng)研究了球孢白僵菌中甘露醇代謝相關(guān)酶和過氧化氫酶的基因家族的時空表達(dá)情況以及各基因缺失對菌株抗逆力和毒力的影響；以球孢白僵菌自身疏水蛋白基因啟動子的克隆及優(yōu)化為切入點，構(gòu)建了高表達(dá)Vip3Aa1蛋白的球孢白僵菌工程菌株，并評價了其對斜紋夜蛾各齡幼蟲雙途徑感染的殺蟲活性。主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下：
　　 甘露醇1-磷酸脫氫酶(MPD)的基因克

4、隆、表達(dá)純化及酶學(xué)特征分析通過序列比對及簡并引物擴增，從球孢白僵菌Bb2860基因組中克隆到甘露醇1-磷酸脫氫酶基因BbMPD，序列全長1334 bp，其開放閱讀框(ORE)長1176 bp，含一個158 bp的內(nèi)含子，編碼一條由391個氨基酸組成的典型的真菌甘露醇1-磷酸脫氫酶，預(yù)測分子量為42.8 kDa，與已知的其它17種真菌MPD蛋白的序列同源性為56～74％，且在N端含有一個NADH輔因子結(jié)合域(GAGRIG)。在大腸桿菌中成

5、功表達(dá)了BbMPD的重組蛋白，其純化產(chǎn)物的最適反應(yīng)溫度為30℃，最適反應(yīng)pH7.0，對果糖6-磷酸具有底物專一性，米氏常數(shù)Km和Vmax分別為0.89±0.05 mM和913.5±14.9 U/mg蛋白，還原D-果糖6-磷酸的催化效率(Kcat/Km)為1.31×104 mM-1 S-1。
　　 甘露醇脫氫酶(MTD)的基因克隆及兩個脫氫酶基因的表達(dá)調(diào)控首次從Bb2860基因組中克隆到甘露醇脫氫酶基因BbMTD，其上游序列有3個

6、脅迫響應(yīng)元件(AGGGG)和5個碳利用阻遏元件CREA(SYGGRG)附著位點的保守序列；ORF全長801bp，編碼266個氨基酸，蛋白分子量和等電點分別為28.2 kDa和6.6，與其它真菌MTD的同源性較高，N端第28個氨基酸處存在一個NADPH輔因子結(jié)合域(GPKGIG)。
　　 BbMTD在菌絲生長的前五天轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平逐步遞增，第五天的表達(dá)量約為第二天的20倍，但在此后的兩天里又有所下降。BbMPD的轉(zhuǎn)錄水平在連續(xù)七天培

7、養(yǎng)過程中保持相對恒定，第4天表達(dá)水平最高。在1 M NaCl的滲透壓脅迫和50 mM H2O2的氧化脅迫下，基因表達(dá)均呈現(xiàn)隨脅迫時間延長而顯著上調(diào)的趨勢，滲透壓脅迫3h后的BbMTD和BbMPD基因表達(dá)水平分別較空白對照提高了5.0和10.9倍；相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄水平在氧化脅迫3h后分別上調(diào)了11.4和74.9倍。兩基因在熱脅迫條件下的表達(dá)水平均受抑制，熱激3h后，BbMPD的表達(dá)水平為正常條件下的63％，而BbMTD只有一半左右。結(jié)果表明

8、，兩基因均參與球孢白僵菌抵抗逆境脅迫的防御反應(yīng)。
　　 BbMPD和BbMTD基因的敲除及突變株表型分析應(yīng)用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法成功構(gòu)建BbMPD和BbMTD基因的缺失突變株ABbMPD和ABbMTD。酶活分析顯示，BbMPD和BbMTD均是球孢白僵菌甘露醇代謝的關(guān)鍵催化酶，△BbMPD菌株粗酶液無法還原果糖6-磷酸，而△BbMTD有低水平的酶活殘留。無論是在固體SDAY平板正常條件下生長，還是在液體SDB脅迫條件下培養(yǎng)

9、，單基因敲除株胞內(nèi)甘露醇含量均顯著低于野生株。在正常生長條件下，△BbMPD和△BbMTD菌絲(或分生孢子)中甘露醇的含量分別減少了68％(83％)和16％(38％)。滲透壓能誘導(dǎo)菌株胞內(nèi)甘露醇的合成，1 M NaCl刺激24 h后，△BbMPD和△BbMTD菌絲甘露醇含量分別提高3.0和1.7倍。而熱激培養(yǎng)則抑制其合成，35℃下培養(yǎng)一天，相應(yīng)的甘露醇合成水平只有正常培養(yǎng)條件下的40.7％和62.3％。有趣的是，各菌株胞內(nèi)甘露醇合成的減

10、少伴隨著海藻糖含量的上升。例如，正常平板培養(yǎng)條件下，△BbMPD菌絲和分生孢子中海藻糖的含量較野生株分別提高1.7倍和1.5倍。
　　 除胞內(nèi)可溶性甘露醇和海藻糖含量變化外，BbMPD基因的敲除顯著影響菌株的產(chǎn)孢能力(下降27％)，而△BbMTD菌株的產(chǎn)孢則不受影響。兩敲除株菌絲和孢子在不同的單一碳源培養(yǎng)基上培養(yǎng)時表型差異明顯。△BbMPD菌絲生長速度不受影響，但分生孢子的萌發(fā)速率較野生株顯著降低，在以果糖，葡萄糖和甘露醇為單一

11、碳源平板上孢子萌發(fā)50％所需的時間(GT50)分別延遲3.0、3.1和6.6h；△BbMTD菌絲生長則受到顯著抑制，但其分生孢子除在甘露醇平板上萌發(fā)延遲之外(GT50后延7.1 h)，萌發(fā)速率在其他碳源平板上差異不顯著?？鼓媪y定顯示，甘露醇合成受阻能致球孢白僵菌的分生孢子對活性氧、高溫、紫外等環(huán)境脅迫的適應(yīng)能力顯著下降。△BbMPD和△BbMTD分生孢子對H2O2的耐受力分別較野生株下降38％和18％，對UV-B輻射的耐受力(LD50

12、：0.26和0.36 J/cm2)比野生株(LD50:0.42 J/cm2)分別下降39％和16％，對45℃熱脅迫的耐受力(LT50:39.0 min和46.1 min)比野生株(52.0 min)分別下降22％和11％。然而，上述基因的缺失不顯著影響菌株對桃蚜的毒力以及對高滲透壓脅迫的耐受力。
　　 球孢白僵菌過氧化氫酶(Catalase，CAT)基因家族的克隆、序列分析及表達(dá)調(diào)控通過保守序列比對從球孢白僵菌2860基因組中克

13、隆到五個CAT基因，分別編碼三種單功能CAT(BbcatA、BbcatB和BbcatC)和兩種雙功能CAT(BbcatP和BbcatD)。其中，BbcatC為小亞基酶，蛋白序列中含有NADPH綁定域，其余四種均為大亞基酶。通過進(jìn)化樹構(gòu)建分析表明，五種CAT分別屬于不同的蛋白家族。其中，BbcatA屬于cladeA(孢子特異性CAT)，主要參與分生孢子的形成及發(fā)育過程，其基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平在產(chǎn)孢過程中逐漸累積，而在孢子萌發(fā)和菌絲開始生長過程

14、中大幅降低；氧化脅迫能提高該基因轉(zhuǎn)錄水平，50 mM H2O2脅迫3 h的表達(dá)水平為空白對照的4.5倍。BbcatB和BbcatD屬于clade B(分泌性CAT)，在蛋白N端均含有一段19個氨基酸的分泌信號肽。BbcatB基因的表達(dá)水平隨菌落生長時間延長而逐漸上調(diào)，第7天的轉(zhuǎn)錄水平達(dá)到第二天的30.2倍。BbcatD基因的表達(dá)在生長的前5天內(nèi)保持較低的水平，而在第6天和第7天顯著增強，分別達(dá)到第二天的53.1和158.3倍。氧化脅迫均

15、能誘導(dǎo)BbcatB和BbcatD基因的表達(dá)，分別提高8.6和6.9倍。BbcatC和BbcatP均屬于clade P(過氧化物酶體CAT)，它們分別在蛋白中間段和C端含有PTS信號序列。BbcatC基因在菌絲生長過程中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量逐漸上升，而BbcatP基因在7天的菌落生長過程中其表達(dá)水平相對平穩(wěn)。與其他四種CAT基因的表達(dá)水平相比，BbcatP基因受H2O2脅迫的影響最為顯著，3 h脅迫處理后，其轉(zhuǎn)錄水平較正常條件提高13.5倍。結(jié)果

16、表明，各CAT在球孢白僵菌生長發(fā)育過程中扮演不同的角色，且不同程度地參與氧化脅迫的防御反應(yīng)。
　　 球孢白僵菌五種過氧化氫酶的生物學(xué)功能分析應(yīng)用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法成功構(gòu)建球孢白僵菌各CAT基因的單敲除株。酶活測定顯示，正常生長條件下，菌絲CAT活力主要取決于BbcatB、BbcatP和BbcatD?；钚匀旧玃AGE凝膠上僅呈現(xiàn)BbcatB(高)和BbcatP(低)兩條酶帶，氧化脅迫及熱激等脅迫條件并不能改變相應(yīng)的酶譜類

17、型?？鼓媪y定表明，△BbcatC和△BbcatP菌絲對氧化脅迫十分敏感，50 mM H2O2幾乎完全抑制△BbcatP菌落的生長，而其它三種CAT的缺失突變株的菌落生長沒有受到明顯抑制?！鰾bcatB菌落生長在含4 mM甲萘醌的培養(yǎng)基上明顯受抑制，其他CAT基因缺失株生長則差異不顯著。在滲透壓(NaCl)、殺菌劑(多菌靈)以及熱脅迫(33℃)條件下，各敲除株的菌落生長表型均未受到顯著影響。另一方面，CAT基因敲除后可顯著影響分生孢子對

18、H2O2、UV-B和高溫的耐受力，但影響程度不同?！鰾bcatA、△BbcatP和△BbcatC分生孢子對H2O2的耐受力分別較野生株下降42.6％、57.0％和34.5％，而△BbcatB和△BbcatD的分生孢子對此氧化脅迫的耐受力未受顯著影響。各敲除株的孢子對UV-B輻射的耐受力也表現(xiàn)不同程度的下降，以△BbcatB和△BbcatD最為顯著，較野生株分別下降52.4％和47.6％。耐熱力測定顯示，△BbcatA分生孢子在45℃熱脅

19、迫下的半致死時間LT50較野生株下降40％，但其余敲除株都與野生株的LT50均為52.0 min。
　　 毒力測定顯示，敲除株△BbcatA、△BbcatP和△BbcatD對斜紋夜蛾二齡幼蟲的毒力顯著低于野生株，其LT50分別較野生株下降1.4天、1.8天和0.9天，而另兩個敲除株與野生株無異，其LT50為5.0～5.1天之間。由此可見，CAT是球孢白僵菌克服昆蟲寄主ROS相關(guān)的抗氧化酶系，因而是影響菌株重要抗逆性狀和毒力的重要

20、因子。
　　 球孢白僵菌內(nèi)源強啟動子Phyd1的克隆與優(yōu)化為了尋找一種可在球孢白僵菌中高表達(dá)外源有益基因的內(nèi)源強啟動子，從Bb2860基因組中克隆到Ⅰ型疏水蛋白基因(hyd1)的上游序列，并分別截成-1798(全長、-1290、-1179、-991和-791 bp)不同長度的片段或?qū)?1290片段特定轉(zhuǎn)錄因子(StuA、NIT2和Mat-Mc)結(jié)合位點施以定點突變后，與綠色熒光蛋白報告基因eGFP融合起來，在球孢白僵菌Bb286

21、0中轉(zhuǎn)化表達(dá)，考察各轉(zhuǎn)化子中eGFP蛋白相對于外源通用啟動子PgpdA調(diào)控的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，攜帶3個必要轉(zhuǎn)錄因子的-1290 bp為最優(yōu)的啟動子片段(Phyd1-t1)，由其驅(qū)動eGFP表達(dá)的轉(zhuǎn)化子菌落的相對熒光強度(RFI)是PgpdA驅(qū)動的15.6倍，且eGFP蛋白主要積累于分生孢子形成階段，尤以成熟的分生孢子中表達(dá)量最高。其他截頭片段或定點突變的啟動子片段啟動基因表達(dá)的效率均不如Phyd1-t1，而-791 bp片段幾乎完全失

22、去啟動外源基因表達(dá)的能力。在定點突變的片段中，以StuA結(jié)合位點的突變影響eGFP基因表達(dá)最甚。
　　 高表達(dá)中腸特異性殺蟲蛋白Vip3Aa1的球孢白僵菌工程株的構(gòu)建及毒力分析將外源Bt營養(yǎng)期殺蟲蛋白基因Vip3Aa1置于優(yōu)化的內(nèi)源啟動子Phyd1-t1下導(dǎo)入野生株Bb2860中，篩選鑒定出一株生長和產(chǎn)孢性狀良好且遺傳穩(wěn)定的工程株BbHV8。實時定量PCR和ELISA分析顯示，與BbV28菌株(本實驗室先前構(gòu)建由PgpdA啟動V

23、p3Aa1表達(dá)的工程菌株)相比，BbHV8培養(yǎng)4天的菌落(菌絲)中Vip3Aa1基因的轉(zhuǎn)錄水平上升112倍，在菌絲和培養(yǎng)7天形成的分生孢子中Vip3Aa1蛋白的表達(dá)量分別提高7.8和9.8倍。Western雜交和免疫膠體金定位分析表明，Vip3Aa1蛋白在BbHV8分生孢子中高表達(dá)且均與分布于細(xì)胞質(zhì)中。孢子被四齡斜紋夜蛾幼蟲攝食24 h后，能在中腸液中通過Western雜交檢測到一條62 kDa的活性條帶。生測實驗表明，BbHV8菌株對

24、斜紋夜蛾二至五齡幼蟲均表現(xiàn)出明顯的Vip3Aa1特有的口服感染毒力，致死蟲尸嚴(yán)重萎縮，保濕培養(yǎng)后長出的菌絲稀薄甚至不長。時間-劑量-死亡率(TCM)觀察顯示，BbHV8的殺蟲速度明顯快于BbV28和Bb2860，高濃度處理下，BbHV8在處理后第三天能分別殺死100％和53％的二、三齡幼蟲，而BbV28和Bb2860在第8天才殺三齡幼蟲62％和45％。
　　 TCM模擬分析顯示，Bb2860、BbV28和BbHV8對斜紋夜蛾二齡

25、幼蟲的LC50隨接種天數(shù)差異顯著。BbHV8對斜紋夜蛾二齡幼蟲的LC50及其95％置信限由第2天的1293(889～1880)孢子/mm2下將至第5天的26(16～44)孢子/mm2。Bb2860和BbV28對三齡幼蟲LC50的差異不顯著，但均顯著高于BbHV8的LC50?；诟骶甑腖C50值，BbHV8處理后3～8天期間對二、三齡幼蟲的毒力分別為BbV28的8～80倍和Bb2860的18～931倍，毒力差異倍數(shù)隨處理后時間延長而縮小

26、。在可比較的處理劑量下，BbHV8對二、三齡幼蟲的LT50比BbV28和Bb2860分別縮短1.5～3.8天和2.9～4.6天，即在給定劑量下，BbHV8的殺蟲速度比BbV28快63～100％，比Bb2860快1.1～1.6倍。此外，BbHV8在處理后3～8天殺死90％二至五齡幼蟲的孢子劑量為678～1389個孢子/mm2，BbV28和Bb2860對三齡幼蟲無可計算的LC50。以上結(jié)果表明，Phyd1-t1能強啟動外源毒素基因的表達(dá)并大

27、量積累毒蛋白于球孢白僵菌分生孢子中，從而大幅提高其對高齡暴食性害蟲的毒力。
　　 綜上所述，本研究主要成果和創(chuàng)新點在于，一是成功克隆了球孢白僵菌中與甘露醇代謝相關(guān)的BbMPD和BbMTD基因，通過基因敲除和表型分析首次揭示了它們在調(diào)控該菌生長發(fā)育、抗逆及毒力性狀中的重要作用。二是首次系統(tǒng)研究了該菌CAT基因種類、結(jié)構(gòu)和功能，闡明了各CAT影響該菌抗逆性狀和毒力的程度。三是發(fā)現(xiàn)了能驅(qū)動外源基因在球孢白僵菌分生孢形成階段特異性超表達(dá)