小麥——葉銹菌互作過程中鈣調素下游蛋白的篩選.pdf

1、細胞內Ca2+H濃度的瞬時升高是觸發(fā)植物防御反應的早期信號。鈣調素(Calmodulin,CaM))作為一類最重要的Ca2+結合蛋白可以通過與其下游CaM結合蛋白(Calmodulin binding protein,CaMBP)作用而調節(jié)細胞的生理功能,所以鑒定和分析病原體激發(fā)的CaMBP將有助于理解Ca2+-CaM信號調節(jié)的防御反應機制。因此,對CaMBP的研究是揭示CaM作用機制的重要內容,是探明Ca2+-CaM信號轉導系統(tǒng)的關鍵

2、。
　　 本實驗室以小麥-葉銹菌互作體系為研究對象,通過鈣信使阻斷或激活藥物試驗、鈣離子的亞細胞定位、激發(fā)子刺激抗病性不同的小麥品種葉肉細胞原生質體后胞質Ca2+變化的研究,證明Ca2+參與了小麥抵抗葉銹菌侵染的信號轉導過程,并且通過實時定量PCR和Western blotting以及抑制性差減雜交技術發(fā)現在不親和互作早期,小麥CaM表達量升高,初步證明小麥CaM也參與了這一過程。
　　 為進一步探討CaM在小麥抵抗葉銹

3、菌侵染的信號轉導過程中的功能和作用機理并尋找與之相互作用的蛋白,本文以小麥鈣調素基因CAM2-3及CAM4-1構建誘餌載體,用Matchmaker Library Construction&Screening Kits在小麥受葉銹菌侵染后構建的酵母雙雜交cDNA文庫中尋找與CaM發(fā)生蛋白.蛋白相互作用的基因,得到了8個陽性克隆。經測序分析,其中408與水稻類乙烯誘導鈣調素結合蛋白(ethylene-inducedcalmodulin-b

4、inding protein4-like)的C端同源性很高,暫時命名為TaCAMTA-like(calmodulin-binding transcription activators-like)。通過雙分子熒光互補技術(Bimolecular fluorescence complementation,BiFC)驗證了所篩選出的TaCAMTA-like蛋白在煙草細胞中也能與CaM發(fā)生相互作用,且它們之間的相互作用即可在細胞質中進行也可在細

5、胞核中進行；對TaCAMTA-like蛋白氨基酸序列進行分析,找到了TaCAMTA-Like可能與CaM相互作用的位點,通過電泳遷移率變化分析試驗進一步證明了該位點與CaM的相互作用。在此基礎上,利用RT-PCR檢測了該基因在小麥接種葉銹菌后在轉錄水平的變化,結果表明在接種后的不親和組合中TaCAMTA-Like的表達量高于模擬接種,且在接種后4-48 h均保持較高水平的表達,在接種后72 h其表達量下降并與對照相近；而親和組合中TaC