棉花和番茄P-ATPases基因的克隆及功能的初步分析.pdf

1、P-type ATPases是真核生物和很多原核生物中具有重要作用的酶，與植物生長發(fā)育以及植物逆境抗性等有密切關(guān)系。目前，還未見到關(guān)于研究棉花和番茄P-typeATPases的報(bào)道。
　　 本研究克隆了棉花和番茄的P-type ATPases基因，分析該基因在植物不同器官組織和多種逆境條件下的表達(dá)情況，并分別轉(zhuǎn)化煙草或番茄，初步闡明其在植物生長發(fā)育和逆境抗性中的作用，為這兩種作物的遺傳改良奠定基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下：
　　

2、 1.利用棉花黃萎病菌(Verticillium dahliae Kleb.)的P-type ATPases蛋白序列，在GeneBank中搜索棉花EST序列，得到棉花兩個同源的EST片段，結(jié)合RACE和Genomewalking獲得了這個基因的完整讀碼框序列，其開放閱讀框長為3570bp，編碼1190個氨基酸，與毛果楊、蓖麻的氨基酸同源相似性達(dá)90％左右，命名為Gbpatp。
　　 亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示Gbpatp編碼的蛋白分布

3、在細(xì)胞膜上。RT-PCR檢測組織表達(dá)特異性分析表明，棉花P-type ATPases在莖和棉鈴中的表達(dá)量較高，在種子中有低水平表達(dá)，而在葉子和花蕾中表達(dá)量極低，說明Gbpatp可能與棉花莖、棉鈴和種子的生長發(fā)育密切相關(guān)。棉花幼苗在干旱處理后，Gbpatp的表達(dá)量大幅提高，并且隨處理時間延長表達(dá)量逐漸增加；重金屬Cu2+處理后Gbpatp的表達(dá)量升高，但48h比24h的表達(dá)量顯著下降；低溫處理24h Gbpatp的表達(dá)量略有升高。外源激素

4、誘導(dǎo)后發(fā)現(xiàn)，Gbpatp對外源GA和ABA均有響應(yīng)，隨誘導(dǎo)時間延長Gbpatp在24h和48h的表達(dá)量維持在一定水平。據(jù)此推測Gbpatp基因與植物逆境抗性有密切關(guān)系。
　　 為研究棉花Gbpatp基因的功能，構(gòu)建過量表達(dá)載體PCXSN-Gbpatp，轉(zhuǎn)化煙草，獲得12株轉(zhuǎn)基因植株。
　　 2.在GeneBank中搜索到番茄的兩個EST序列與黃萎病菌(Verticillium dahliae Kleb.)的P-type

5、ATPases蛋白序列同源，分別為TC192175和 BP896315。將檢索到的EST序列對照BAC文庫進(jìn)行比對和拼接，根據(jù)生物學(xué)軟件預(yù)測開放閱讀框，并設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增番茄cDNA序列，得到一完整序列，命名為Lepatp。
　　 根據(jù) Lepatp基因序列構(gòu)建RNA干擾載體2301-P1-P2，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化番茄，再生植株經(jīng)PCR檢測，獲得11株轉(zhuǎn)基因植株。轉(zhuǎn)基因植株RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)5株植株沒有檢測到Lepatp基因，說明L

6、epatp基因的表達(dá)已成功被抑制。與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ障啾?，Lepatp基因的表達(dá)沉默抑制了根系的發(fā)育，說明Lepatp基因與植物根系的生長發(fā)育相關(guān)，可能影響植物的營養(yǎng)吸收、生長和抗逆性等。
　　 3.根據(jù)已克隆的番茄Lepatp基因序列，電子克隆該基因的啟動子序列，并構(gòu)建植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化擬南芥。PCR檢測獲得4株轉(zhuǎn)基因植株。為了觀察番茄P-type ATPases基因啟動子在擬南芥中的表達(dá)特征，取轉(zhuǎn)基因擬南芥的各個器官進(jìn)行GUS組織