油茶DGAT1基因的全長(zhǎng)cDNA克隆與原核表達(dá).pdf

1、油茶(Camellia oleifera)是我國(guó)南方重要的木本油料樹種，茶油中富含油酸、亞油酸等不飽和脂肪酸，為優(yōu)質(zhì)食用油。但油茶種子含油率低，直接影響油茶的發(fā)展和經(jīng)濟(jì)效益的發(fā)揮。三酰甘油(TAG)是油茶最主要的儲(chǔ)存脂類，而二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶(DGAT)是TAG合成的Kennedy途徑中唯一的限速酶，其主要作用是催化二酰甘油加上酰基脂肪酸形成三酰甘油，可見(jiàn)DGAT酶對(duì)TAG的累積起著直接作用。因此開展油茶DGAT基因的克隆和功能分析，對(duì)

2、揭示油茶油脂合成的分子機(jī)制有重要意義。本論文主要研究結(jié)果如下：
　　 (1)油茶DGAT1基因的分離鑒定。在GeneBank中以DGAT為關(guān)鍵詞進(jìn)行搜索，選出5條產(chǎn)油植物DGAT1的氨基酸序列和全長(zhǎng)cDNA序列，通過(guò)比對(duì)分析，在保守區(qū)設(shè)計(jì)了一對(duì)簡(jiǎn)并引物。以國(guó)家審定油茶優(yōu)良品種--‘華碩’的近成熟種子胚乳為材料提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA，通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增出了一條大小約500bp的條帶，測(cè)序得到506bp的部分cDNA序列

3、。并在網(wǎng)上進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，確認(rèn)所得片段為油茶DGAT1部分基因片段。
　　 (2)油茶DGAT1基因的全長(zhǎng)cDNA克隆及生物信息學(xué)分析。根據(jù)油茶DGAT1基因的部分cDNA序列信息，設(shè)計(jì)了3條油茶DGAT1基因5’RACE特異引物和兩條3’RACE用的特異引物。以‘華碩’的近成熟胚乳為材料提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄制備RACE ready cDNA，進(jìn)行5’RACE和3’RACE擴(kuò)增。拼接的序列在NCBI中BLAST確認(rèn)為油茶

4、DGAT1基因的全長(zhǎng)cDNA序列，該基因命名為co-dgatl。通過(guò)Vector NTI9.0等生物軟件的分析，此cDNA序列長(zhǎng)1893bp，包含1個(gè)1548bp完整的CDS及121bp5’UTR和229bp3’UTR，編碼515個(gè)氨基酸。應(yīng)用一系列生物信息學(xué)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，結(jié)果顯示：其蛋白分子量為58.44 k Da，理論等電點(diǎn)為8.70，其中正電荷氨基酸殘基數(shù)目為46，負(fù)電荷氨基酸殘基數(shù)目為38；CODGAT1蛋白質(zhì)不穩(wěn)定系數(shù)為46.