哈維氏弧菌寡肽透性酶原核表達、突變株構(gòu)建及其性質(zhì)研究.pdf

1、哈維氏弧菌是一種革蘭氏陰性菌,是發(fā)光弧菌的主要成員之一。在海洋環(huán)境及魚、甲殼類和無脊椎動物等海洋動物中廣泛存在。許多國家爆發(fā)的大規(guī)模性對蝦死亡及中國和南亞一些國家報道的魚的致病都跟哈維氏弧菌有關(guān)。
　　 一些革蘭氏陰性菌例如大腸桿菌有三套肽轉(zhuǎn)運系統(tǒng),以幫助它運輸多種底物,滿足其對氮源寬泛的需求。這三個系統(tǒng)為二肽透性酶(Dpp),三肽透性酶(Tpp)和寡肽透性酶(Opp)。寡肽轉(zhuǎn)運系統(tǒng)屬于ABC型轉(zhuǎn)運家族全轉(zhuǎn)運蛋白型,由5個亞基組

2、成:1個胞外寡肽結(jié)合蛋白(oppA),它負責與進入細胞的底物特異性地結(jié)合,將其傳輸給轉(zhuǎn)運蛋白(translocator)；形成運輸通道的2個跨膜蛋白(oppB／oppC)；2個核酸結(jié)合區(qū)(oppD／oppE)。它是一個溶質(zhì)結(jié)合蛋白,不僅為細菌生長提供碳源和氮源,還參與胞內(nèi)信號傳導。越來越多的證據(jù)顯示ABC型轉(zhuǎn)運蛋白與細菌的致病性相關(guān)。
　　 從哈維氏弧菌SF-1基因組中用PCR擴增得到特異性片段,含寡肽結(jié)合蛋白基因,該基因全長1

3、665 bp,編碼554個氨基酸。以哈維氏弧菌SF—1基因組DNA為模板,將擴增的基因片段與克隆載體pMD-19T連接,構(gòu)建重組質(zhì)粒并測序,序列分析發(fā)現(xiàn)與創(chuàng)傷弧菌,副溶血弧菌,河弧菌等的寡肽結(jié)合蛋白具有很高的相似性；將目的片段與表達載體pET-28a(+)連接構(gòu)建重組質(zhì)粒,將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21；經(jīng)IPTG誘導表達,用鎳親和層析純化重組蛋白,SDS-PAGE檢測發(fā)現(xiàn)破碎的菌體和上清中均表達出大小為58 kDa左右的目的蛋白。
　

4、　 純化的重組寡肽結(jié)合蛋白具有磷脂酶C活性和溶血活性。蛋白磷脂酶C活性的最適溫度為55℃,當高于46℃時,酶活力急劇下降。在66℃時,磷脂酶的活力幾乎全部喪失。酶的最適反應pH值為8.0,在pH為7.0時,酶活力比較穩(wěn)定。將純化的蛋白注射斑馬魚,導致魚的死亡,魚鰓部和腹部均有出血現(xiàn)象,表明該蛋白具有致病性。
　　 擴增寡肽透性酶基因ORF97-604區(qū)間507 bp的片段,連接克隆載體pMD-19T,并連接自殺質(zhì)粒pNQ705