水稻條斑病菌致病相關(guān)基因的鑒定與功能研究.pdf

1、水稻條斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola，Xoc)是水稻黃單胞菌(Xanthomonas oryzae)種下兩致病變種之一，引起水稻細(xì)菌性條斑病(Bacterial LeafStreak，簡(jiǎn)稱條斑病，BLS)。近年來該病發(fā)生日趨嚴(yán)重，成為水稻上第四大病害。該病原菌從氣孔或傷口侵入，在薄壁細(xì)胞間繁殖與危害，因受葉脈限制產(chǎn)生條斑病癥狀。由于感病雜交水稻大面積推廣，且生產(chǎn)上無有效的抗條斑病種質(zhì)資源，水稻安全

2、生產(chǎn)受到嚴(yán)重的威脅。近年來，X.oryzae pv.oryzicola大量致病性相關(guān)基因(如hrp、avr、rpf及其它毒性候選基因等)的研究揭示，毒性相關(guān)基因的鑒別是全面解析病原菌致病機(jī)理以及發(fā)展高效生物防治的基礎(chǔ)。
　　 目前，構(gòu)建植物病原菌突變體庫是挖掘新基因和進(jìn)行功能基因組學(xué)研究的有效途徑。因此，為了從全基因組范圍內(nèi)挖掘X.oryzae pv.oryzicola致病性相關(guān)因子，本研究以RS105為出發(fā)菌株，構(gòu)建了一個(gè)包含

3、25，000突變子的X.oryzae pv.oryzicola Tn5轉(zhuǎn)座子插入突變體庫，約5×ORF于基因組(約4，600個(gè)ORF)的覆蓋量。Southern Blot分析表明，Tn5插入突變體庫是穩(wěn)定的、隨機(jī)的。將每個(gè)突變子分別接種感病寄主水稻(cv.Shanyou63)，經(jīng)第一輪篩選共獲得了1，753個(gè)致病性完全喪失或毒性減弱的突變體。為了進(jìn)一步驗(yàn)證其在水稻上的致病表型，經(jīng)第二輪篩選，共獲得了114個(gè)致病性完全喪失或毒性顯著減弱的

4、突變體，其中致病性完全喪失的14個(gè)。隨后，將114個(gè)致病性完全喪失或毒性顯著減弱的突變體分別接種非寄主煙草(cv.Xanthi)，共獲得23個(gè)過敏性反應(yīng)(hypersensitive response，HR)喪失或明顯減弱的突變體，其中HR完全喪失的15個(gè)。以上突變體的獲得，為分析X.oryzae pv.oryzicola致病性相關(guān)基因提供了材料基礎(chǔ)。
　　 為了快速準(zhǔn)確地確定Tn5插入的位點(diǎn)和具體功能基因，本研究采用熱不對(duì)稱交

5、錯(cuò)PCR(TAIL-PCR)技術(shù)對(duì)114個(gè)致病性完全喪失或顯著減弱的突變體進(jìn)行了鑒別。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)座子Tn5插入在致病性相關(guān)基因上，包括hrp、avr、rpf、 wxoc、代謝相關(guān)基因、conserved hypothetical protein及其它毒性基因等。大批致病相關(guān)基因的發(fā)現(xiàn)，不僅為從分子水平上解析X.oryzae pv.oryzicola的致病機(jī)理，而且對(duì)于揭示植物-病原物互作的致病性和抗病性，具有全局性的科學(xué)價(jià)值。

6、　　 關(guān)鍵毒性基因的功能鑒定是理解X.oryzae pv.oryzicola致病機(jī)理的先決條件。為此，對(duì)27個(gè)在水稻上完全喪失致病性或毒性顯著減弱的突變體進(jìn)行了分析。其中14個(gè)突變體完全喪失在水稻上的致病性和在煙草上激發(fā)過敏性反應(yīng)(hypersensitiveresponse，HR)的能力(表型為Pth-/HR-);另外13個(gè)突變體全毒性顯著減弱，但仍具有在煙草上激發(fā)HR的能力(Vir-/HR+)。Tn5插入基因序列分析揭示，14個(gè)P

7、th-/HR-突變體是Tn5插入在以下基因上:hrcC(2個(gè))、hrcT、hrcV(4個(gè))、hpaP、hrcQ(2個(gè))、hrpF、hrpG和hrpX(2個(gè));13個(gè)Vir-/HR+突變體被Tn5插入的基因分別是:tal-C(l)0c-like(TAL效應(yīng)分子)、rpfC(致病性調(diào)控子)、oxyP(過氧化壓力調(diào)控子)、dsbC(二硫化合物異構(gòu)酶)、opgH(葡聚糖生物合成葡(萄)糖基轉(zhuǎn)移酶H)、rfbA(1-磷酸葡萄糖乙?；D(zhuǎn)移酶)、am

8、tR(氨基轉(zhuǎn)移酶)、purF(氨基磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶)、thrC(蘇氨酸合成酶)、trpA(色氨酸合成酶a亞基)和3個(gè)功能未知蛋白的基因Xoryp_02235、 Xoryp_00885和Xoryp_22910。即這27個(gè)突變體是Tn5插入在21個(gè)不同的ORFs上。此外上述13個(gè)全毒性減弱的突變體，功能互補(bǔ)都能恢復(fù)至野生型水平，這表明amtR、purF、thrC、trpA、Xoryp_02235、Xoryp_00885扣Xoryp_22910

9、是參與X.oryzae pv.oryzicola全毒性的新基因，未見在其它植物病原細(xì)菌中報(bào)道。Real-time PCR證明，上述7個(gè)新毒性基因在植物中是受誘導(dǎo)表達(dá)的，但是它們?cè)趨⑴cX.oryzae pv.oryzicola致病機(jī)理上的詳細(xì)功能，仍需進(jìn)一步的研究。
　　 植物病原細(xì)菌與寄主互作的一個(gè)重要方面是病原菌在植物組織內(nèi)獲取營(yíng)養(yǎng)的能力。碳水化合物的獲取對(duì)于病原菌在寄主植物中生長(zhǎng)繁殖、成功建立營(yíng)養(yǎng)寄生關(guān)系至關(guān)重要。盡管代謝途

10、徑一般不認(rèn)為是毒性因子，但是闡述碳水化合物獲取與代謝的詳細(xì)機(jī)制對(duì)于全面理解X.oryzae pv.oryzicola的寄生性和致病性具有重要科學(xué)意義。
　　 果糖-1，6-二磷酸醛縮酶(FbaB)，是有機(jī)生物體糖酵解和糖異生途徑中的一個(gè)重要代謝酶。X.oryzae pv.oryzicola基因組中唯一的fbaB基因突變，不僅導(dǎo)致病原菌喪失利用丙酮酸和蘋果酸進(jìn)行生長(zhǎng)的能力，也延緩其利用果糖作為唯一碳源時(shí)的生長(zhǎng);而且也降低了胞外多糖

11、(EPS)的產(chǎn)量及降低了細(xì)菌在水稻上毒性和生長(zhǎng)。經(jīng)序列分析發(fā)現(xiàn)fbaB啟動(dòng)子區(qū)含有一個(gè)不完全的PIP-box(Plant-inducible promoter,TTCGT-N9-TTCGT)。有意義的是，fbaB的表達(dá)受hrp調(diào)控子HrpG和HrpX的負(fù)調(diào)控，且PIP-box堿基置換改變了它們對(duì)fbaB的調(diào)控。Real-time PCR結(jié)果顯示，RS105菌株中的fbaB在植物中是受誘導(dǎo)表達(dá)的;而且fbaB缺失抑制了hrpG和hrpX的

12、表達(dá)，hrcC、 hrpE和hpa3的轉(zhuǎn)錄反而增強(qiáng)，對(duì)其余的hrp-hrc-hpa基因表達(dá)沒有影響。而碳源利用能力測(cè)定揭示，hrcC、hrpE和hpa3突變體相應(yīng)減弱了病原菌利用丙酮酸和蘋果酸的能力。另外，fbaB突變體在植物上的毒性和生長(zhǎng)以及EPS的產(chǎn)量，功能互補(bǔ)能夠完全恢復(fù)至野生型水平。這是第一次報(bào)道表明，X.oryzae pv.oryzicola吸收的碳水化合物在fbaB基因位點(diǎn)通過一個(gè)未知因子在調(diào)節(jié)hrp基因的表達(dá)上扮演著重要作

13、用。
　　 另外，對(duì)X.oryzae pv.oryzicola全基因組搜索發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)編碼6-磷酸葡萄糖脫氫酶的基因，催化6-磷酸葡萄糖轉(zhuǎn)化成6-磷酸葡萄糖酸，在2-酮-3-脫氧-6-磷酸葡糖酸裂解途徑(ED途徑)與磷酸戊糖途徑中發(fā)揮著重要作用。為了明確這兩個(gè)基因的功能，本研究對(duì)X.oryzae pv.oryzicola中起主導(dǎo)作用的zwf(Xoryp_12765)基因進(jìn)行了缺失突變。結(jié)果顯示，zwf突變后，病原菌利用葡萄糖、果糖

14、、蔗糖、甘露糖和半乳糖的能力顯著降低，但不影響其利用丙酮酸或蘋果酸的能力。這表明，zwf突變可能阻礙了磷酸戊糖途徑和ED途徑，但不影響糖異生途徑。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)zwf是受誘導(dǎo)表達(dá)的，相對(duì)于無糖條件下的，葡萄糖、蔗糖、果糖、甘露糖及半乳糖均顯著增強(qiáng)zwf的轉(zhuǎn)錄水平達(dá)3倍以上。有趣的是，zwf突變導(dǎo)致DSF信號(hào)通路關(guān)鍵基因如rpfF、rpfG、clp基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)發(fā)生改變，這暗示，zwf可能參與對(duì)DSF下游某些毒性因子的調(diào)控。此外，zwf突變，

15、X.oryzae pv.oryzicola胞外蛋白水解酶活性增強(qiáng)，胞外多糖的產(chǎn)量降低、游動(dòng)性及水稻上的毒性減弱。經(jīng)功能互補(bǔ)能夠完全恢復(fù)至野生型水平。這些結(jié)果說明，zwf是X.oryzae pv.oryzicola全毒性所需的。
　　 6-磷酸葡萄糖異構(gòu)酶在碳水化合物代謝中具有重要作用，可逆的催化6-磷酸葡萄糖轉(zhuǎn)化成6-磷酸果糖。Xoryp_10540(pgi)是X.oryzae pv.oryzicola全基因組中6-磷酸葡糖異構(gòu)

16、酶唯一編碼基因。實(shí)驗(yàn)表明，pgi突變致使病原菌不能有效利用果糖、蔗糖、甘露糖、丙酮酸，但是不影響其在葡萄糖或半乳糖作為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。值得一提的是，pgi突變導(dǎo)致DSF信號(hào)通路關(guān)鍵基因rpfF、 rpfG、clp基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)發(fā)生顯著改變。DSF信號(hào)檢測(cè)顯示，pgi突變體產(chǎn)生的DSF信號(hào)較野生型RS105水平明顯減弱。這些結(jié)果提示，pgi突變可能對(duì)DSF信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)下游基因的表達(dá)有一定的影響。同樣地，pgi突變降低了病原菌的胞外

17、多糖(EPS)的產(chǎn)量、游動(dòng)性，并減弱病原菌在水稻上的毒性。功能互補(bǔ)能夠完全恢復(fù)至野生型水平。這些結(jié)果說明，pgi是X.oryzae pv.oryzicola EPS產(chǎn)生和全毒性所需的。
　　 水稻白葉枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae，Xoo)是水稻黃單胞菌(Xanthomonas oryzae)種下另一致病變種，通過T3SS將各類效應(yīng)蛋白注入寄主植物細(xì)胞內(nèi)，引起水稻白葉枯病(bacterial b

18、light，BB)，是水稻上三大病害之一。病原菌通過葉尖和葉緣上的水孔侵入水稻葉片，定殖于維管束中并在木質(zhì)部進(jìn)行傳播。依據(jù)本實(shí)驗(yàn)室基因芯片數(shù)據(jù)，篩選獲得一個(gè)參與X.oryzae pv.oryzae能量代謝的基因，PXO_03531(ketoglutarate transport protein，kgtP)。該基因在hrpX或hrpG突變體中的表達(dá)顯著下調(diào)。分析發(fā)現(xiàn)，kgtP啟動(dòng)子區(qū)存在一個(gè)不完全的PIP-box(TTCGA-N21-TT

19、CGC)，且其編碼產(chǎn)物KgtP的N端前50個(gè)氨基酸具有典型的Ⅲ型分泌信號(hào)。這提示，X.oryzae pv.oryzae kgtP可能是HrpX的調(diào)節(jié)子及T3SS效應(yīng)分子。RT-PCR實(shí)驗(yàn)證實(shí)，HrpX和HrpG正調(diào)控kgtP的表達(dá)。免疫雜交結(jié)果顯示，KgtP依賴T3SS，但不依賴于T3S出口控制蛋白HpaB進(jìn)行分泌。細(xì)胞定位結(jié)果顯示KgtP定位在細(xì)胞膜上，推測(cè)其結(jié)合到植物細(xì)胞膜上從而有利于從植物體內(nèi)獲取α-酮戊二酸。kgtP缺失突變，減

20、弱了病原菌在植物上的生長(zhǎng)與毒性，且細(xì)菌不能在含有α-酮戊二酸或琥珀酸鈉為唯一碳源的基本培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，功能互補(bǔ)能有效恢復(fù)至野生型水平。RT-PCR結(jié)果顯示，X.oryzae pv.oryzae在加入α-酮戊二酸為唯一碳源的基本培養(yǎng)基或與水稻懸浮細(xì)胞互作，kgtP的表達(dá)受到顯著誘導(dǎo)，表明kgtP是受誘導(dǎo)表達(dá)的。有趣的是，kgtP缺失突變可以導(dǎo)致水稻上合成α-酮戊二酸的異檸檬酸脫氫酶基因表達(dá)明顯下降。據(jù)此推測(cè)，在腐生狀態(tài)下，X.oryzae