毒死蜱降解細(xì)菌的篩選、降解特性及其固定化研究.pdf

1、有機(jī)磷農(nóng)藥以其高效、廉價(jià)等特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用，但其對(duì)人體健康和環(huán)境等影響較大是不容忽視的問(wèn)題。目前國(guó)內(nèi)外已報(bào)道的甲基對(duì)硫磷降解菌有假單胞菌（Pseudomonassp.）、黃桿菌（Flavobacterium sp.）、產(chǎn)堿菌（Alcaligenes sp.）和節(jié)桿菌（Arthrobacter sp.）
　　 等；毒死蜱降解菌有阿氏腸桿菌（Enterobacter asburiae）、鞘氨醇單胞菌（Sphingomonassp.）

2、和玫瑰紅紅球菌（Rhodocouus rhodochrous）等。但是已報(bào)道的細(xì)菌由于環(huán)境適應(yīng)性不強(qiáng)等原因，還未達(dá)到開(kāi)發(fā)利用的要求，因此仍需篩選更加高效的專性或兼性降解菌。
　　 另外，有關(guān)同一菌種的不同菌株對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥的降解差異性也鮮有報(bào)道。本研究旨在尋找高效降解有機(jī)磷農(nóng)藥的菌株，明確菌株的分類學(xué)地位，同時(shí)探討環(huán)境條件對(duì)菌株降解有機(jī)磷農(nóng)藥的影響、單株菌的降解動(dòng)力學(xué)和降解混合菌的構(gòu)建。進(jìn)一步提取降解酶，優(yōu)化產(chǎn)酶條件，明確降解酶的

3、酶促降解特性，進(jìn)而研究?jī)?yōu)勢(shì)菌株的固定化條件和特性。研究結(jié)果如下：
　　 1.采用直接分離與富集馴化培養(yǎng)相結(jié)合的方法，分離篩選出三株能夠降解有機(jī)磷農(nóng)藥的菌株HY-1、HY-2和HY-4，在形態(tài)特征和生理生化分析的基礎(chǔ)上，又對(duì)其16S rDNA序列進(jìn)行了分析，并研究了其對(duì)甲基對(duì)硫磷（Methyl-parathion）、毒死蜱（Chlorpyrifos）三唑磷（Triazophos）的降解特性。結(jié)果表明：三菌株為蠟狀芽孢桿菌（Baci

4、llus cereus）的不同菌株，三菌株在Genbank上的登錄號(hào)分別為：eu915687、eu915686和eu915688。
　　 三菌株在72 h內(nèi)對(duì)初始濃度為50 mg/L甲基對(duì)硫磷的降解率分別達(dá)到91.7％、88.7％與92.4％，菌株之間無(wú)顯著性差異（P>0.05）；在毒死蜱初始濃度為50 mg/L和100 mg/L時(shí)，HY-1和HY-4降解毒死蜱的能力和HY-2有顯著性差異（P<0.05），其中三菌株在72 h內(nèi)

5、對(duì)100 mg/L毒死蜱的降解率分別達(dá)到64.8％、53.7％和59.5％；三菌株在72 h內(nèi)對(duì)初始濃度為100 mg/L三唑磷的降解率分布在13.3％-20.7％之間，其中HY-2對(duì)三唑磷的降解率較高，并和其余兩菌株有顯著性差異（P<0.05）。可以看出，蠟狀芽孢桿菌的不同菌株對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥的降解存在差異性。
　　 2.以單因素試驗(yàn)探討了三菌株降解甲基對(duì)硫磷和毒死蜱的影響因素，得出了三菌株降解有機(jī)磷農(nóng)藥的最適環(huán)境條件。結(jié)果表明：

6、菌株HY-2能夠利用甲基對(duì)硫磷和毒死蜱為唯一磷源降解農(nóng)藥。HY-2降解甲基對(duì)硫磷的適宜條件為：培養(yǎng)溫度30 ℃–35 ℃、初始pH為6–8、甲基對(duì)硫磷初始濃度為10–50 mg/L、接種量20％（體積比，菌體密度：稀釋到菌懸母液（OD600=3.0）的0.8倍），添加葡萄糖不能促進(jìn)菌株對(duì)甲基對(duì)硫磷的降解；HY-2降解毒死蜱的適宜條件為：葡萄糖濃度6 g/L、培養(yǎng)溫度30 ℃–35 ℃、初始pH為7、毒死蜱初始濃度為80-200 mg/L

7、、接種量20％（體積比，菌體密度：稀釋到菌懸母液（OD600=3.0）的0.8倍）。HY-1和HY-4兩菌株降解毒死蜱的適宜條件為：葡萄糖濃度3G/L、培養(yǎng)溫度35℃、初始pH為7–8、毒死蜱初始濃度80 mg/L、接種量20％（體積比，菌體密度：稀釋到所配菌懸母液（OD600=2）的0.5倍）。酵母膏含量對(duì)毒死蜱的降解影響表明，當(dāng)添加3G/L的葡萄糖時(shí)，最適的酵母膏含量為1 g/L，而不添加葡萄糖時(shí)，最適的酵母膏含量為5 g/L。在酵

8、母膏試驗(yàn)濃度范圍之內(nèi)，不添加葡萄糖時(shí)菌株對(duì)毒死蜱的降解率最終也不能達(dá)到含有葡萄糖的水平。
　　 3.采用種子液培養(yǎng)基中定量添加毒死蜱和定時(shí)取樣分析毒死蜱殘留濃度的方法，明確了毒死蜱對(duì)蠟狀芽孢桿菌的生長(zhǎng)抑制動(dòng)力學(xué)和菌株對(duì)毒死蜱的降解動(dòng)力學(xué)，同時(shí)研究了降解菌對(duì)高濃度毒死蜱的耐受度和菌膠團(tuán)的形成能力。結(jié)果表明：HY-1、HY-2和HY-4三菌株最適種子液培養(yǎng)時(shí)間分別為10、19和15 h。含毒死蜱培養(yǎng)液和空白對(duì)照相比，HY-1和HY-

9、2兩菌株生長(zhǎng)的適應(yīng)期延長(zhǎng)，對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期順序后延。隨著培養(yǎng)液中菌體數(shù)量的增長(zhǎng)，培養(yǎng)液的pH也隨之升高。接菌量為8％（V/V）時(shí)降解率最高。HY-1和HY-2兩菌株對(duì)不同濃度的毒死蜱表現(xiàn)出不同的降解規(guī)律。對(duì)于低濃度的毒死蜱，毒死蜱的濃度隨著時(shí)間的推移而下降；當(dāng)毒死蜱濃度較高時(shí)，毒死蜱的降解過(guò)程包括吸附、解吸和降解等幾個(gè)階段。一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程ln（C0/Ct)=kt可以用來(lái)擬合毒死蜱的降解動(dòng)力學(xué)及確定降解動(dòng)力學(xué)參數(shù)。研究發(fā)現(xiàn)，菌株HY-2比H

10、Y-1可以耐受更高的毒死蜱濃度，但HY-1的菌膠團(tuán)形成能力要高于HY-2。
　　 4.為明確蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）混合菌株對(duì)毒死蜱的降解效果，本研究采用正交試驗(yàn)的方法構(gòu)建混合菌。以混合菌對(duì)毒死蜱的降解率和菌株的生長(zhǎng)量為依據(jù)，利用單一因素試驗(yàn)考察了不同因素對(duì)混合菌降解毒死蜱的影響。兩菌株組合時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，HY-1和HY-4兩菌株的比例為1:1（V/V）時(shí)，對(duì)80 mg/L毒死蜱的降解率最高。添加葡萄糖有助于菌

11、株的生長(zhǎng)，但是不利于毒死蜱的降解。偏堿性環(huán)境對(duì)菌株的生長(zhǎng)有利，對(duì)毒死蜱的降解也有利。菌株的降解動(dòng)力學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，兩菌株混合對(duì)毒死蜱的降解和單菌的降解規(guī)律相似。兩菌株混合時(shí)能夠耐受20–70 g/L的NaCl濃度，且對(duì)80 mg/L毒死蜱的降解率都在41％以上。利用正交試驗(yàn)構(gòu)建的三菌株組合降解混合菌的體積比為：1:1:3。
　　 在含80 mg/L毒死蜱的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，接菌量為8％（V/V）時(shí)降解率最高，降解最適pH值為7。在試驗(yàn)濃

12、度下，三菌株混合菌對(duì)毒死蜱的降解也符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程。混合菌對(duì)高鹽具有很高的耐受度，當(dāng)反應(yīng)液中NaCl濃度在20–100 g/L之間時(shí)，三菌株混合菌對(duì)80 mg/L毒死蜱的降解率仍較高，最高達(dá)61％。
　　 5.以從蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）HY-1菌株中提取到的降解酶比活力為指標(biāo)，進(jìn)行產(chǎn)酶培養(yǎng)基和發(fā)酵條件的優(yōu)化研究。通過(guò)單一因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，對(duì)菌株HY-1的產(chǎn)酶培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化。運(yùn)用SPSS 1

13、3.0軟件進(jìn)行結(jié)果分析，所獲優(yōu)化培養(yǎng)基配方為：葡萄糖6.0 g/L、胰蛋白胨2.2 g/L、K2HPO4 2.0 g/L、KH2PO40.2 g/L、MgSO4·7H2O 0.1 g/L、NaCl 0.1 g/L和微量元素溶液2 mL/L。菌株發(fā)酵培養(yǎng)的優(yōu)化條件為：種子液培養(yǎng)時(shí)間16 h、發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間18 h、接種量1％（V/V）、發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值為7.0。在NaCl 濃度為0?30 g/L 時(shí)，所產(chǎn)降解酶比活力不受影響。這是已報(bào)道

14、的耐鹽性最強(qiáng)的一株毒死蜱降解菌。
　　 6.為明確毒死蜱降解菌-蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）HY-1的粗酶液對(duì)毒死蜱的降解特性，采用測(cè)定粗酶比活力的方法，研究了不同環(huán)境因素對(duì)粗酶液降解毒死蜱的影響。結(jié)果表明：粗酶液中可溶性蛋白的含量為2.21 g/L，測(cè)得粗提酶其米氏常數(shù)Km 為1.2356 mmol/L，最大降解速率VmaX為0.0226 μmol/（mg·min）。酶促反應(yīng)時(shí)間為1 h 時(shí)，粗酶液對(duì)50 m

15、g/L 毒死蜱的降解率最高可達(dá)74％，粗酶液加入量為1 mL 時(shí)的比活力最高。在20℃?44℃的溫度范圍內(nèi)，粗酶液都能保持較好的降解活性，其中最適溫度為28 ℃；在pH5?9之間時(shí)，粗酶比活力都能達(dá)最高比活力的66％以上，最適pH為6。
　　 進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，該粗提酶具有較好的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性，在溫度為-20℃?40 ℃，pH為4?8的條件下，暴露1 h 仍能保持較高的比活力。該粗酶液在10?70 g/L的NaCl濃度下保持

16、1 h 仍能高效降解毒死蜱。該降解粗酶與國(guó)內(nèi)外已報(bào)道的毒死蜱降解粗酶相比，其耐鹽性是最高的，故進(jìn)一步開(kāi)發(fā)應(yīng)用價(jià)值較大。
　　 7.以海藻酸鈉為載體，采用注射器滴定方法將蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）HY-1用海藻酸鈉溶膠包埋，研究固定化菌對(duì)毒死蜱的降解效果。結(jié)果表明：海藻酸鈉固定化菌能高效降解基礎(chǔ)培養(yǎng)基中100 mg/L的毒死蜱。當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為60 h時(shí)，固定化菌對(duì)100mg/L毒死蜱的降解率最大。固定化菌顆粒接入