鹽脅迫紅麻葉片差異蛋白質(zhì)組學及其抗氧化酶活性的分析.pdf

1、紅麻(Kenaf)是錦葵科(Malvaceae)木槿屬(Hibiscus)一年生韌皮纖維作物,具有耐旱、耐鹽、耐貧瘠、生物產(chǎn)量高等特性。巨大的生物產(chǎn)量是樹木的3-4倍,極強的二氧化碳吸收能力為森林的4-5倍。我國沿海新墾鹽堿地和華北、西北、東北地區(qū)的內(nèi)陸次生鹽堿地大量未被開墾,這些鹽堿地均可因地制宜種植紅麻,利用山地、鹽堿地、邊雜地種植紅麻成為低碳產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要方向。
　　 本研究重點用蛋白組學方法鑒定紅麻抵御鹽脅迫的相關(guān)功能蛋

2、白,并初步了解其功能,擬探明紅麻抵御鹽害的蛋白質(zhì)水平上的機理。此外,也進一步分析了鹽脅迫條件下紅麻抗氧化酶系統(tǒng)活性的變化趨勢,以及它們之間相互協(xié)調(diào)作用的關(guān)系,這些都為進一步研究紅麻耐鹽分子和生化機理和為鹽堿地利用及指導紅麻生產(chǎn)栽培提供理論基礎(chǔ)。
　　 本研究首先建立和優(yōu)化了紅麻雙向電泳體系。以福紅952新鮮葉片為材料,分別采用了TCA-丙酮法、尿素-硫脲法、酚抽提法提取葉片蛋白,在蛋白提取效率,單向和雙向電泳圖譜等方面比較了這三

3、種方法的提取效果,同時還從IPG干膠條pH范圍選擇、上樣方式、上樣量、分離膠濃度這幾個主要方面優(yōu)化了體系。結(jié)果表明:用酚抽提法提取的蛋白純度較高,單向和雙向電泳圖譜效果較好,獲得了26條蛋白質(zhì)條帶和1436個蛋白質(zhì)點。紅麻蛋白主要分布在pH4～7范圍內(nèi),采用主動水化上樣,上樣量為1.4mg,12％的分離膠來分離可得到蛋白點清晰,分布均勻,背景清楚的凝膠圖譜。
　　 接著利用優(yōu)化后的蛋白組學雙向電泳體系來研究鹽脅迫下紅麻的差異蛋白

4、。將福紅952幼苗分別在0、70、140、200 mM NaCl的半強度Hoagland營養(yǎng)液下處理6 d后,用酚抽提法提取葉片蛋白,蛋白用雙向電泳分離(pH4-7膠條,12.5％gel)。實驗最少進行三次獨立重復,用ImageMaster7.0軟件分析得知:平均每塊凝膠大約有1000個蛋白點成功匹配,在表達量大于2倍和Anova<0.05條件下可得到62個表達差異點,經(jīng)MALDI-TOF質(zhì)譜分析共鑒定出放氧增強蛋白、小熱休克蛋白、脫氫

5、抗壞血酸還原酶、硝酸還原酶、超氧化物歧化酶等42個差異蛋白,其中S-腺苷甲硫氨酸依賴甲基是經(jīng)脅迫誘導產(chǎn)生的,36個蛋白在鹽脅迫下表達量有所上調(diào),6個蛋白下調(diào)。這些蛋白按主要功能可分為物質(zhì)代謝、蛋白合成與降解、細胞防御、細胞生長、離子轉(zhuǎn)運、光和作用等。果糖二磷酸醛縮酶表達量的下調(diào)影響了糖和淀粉的合成和積累,這可能導致紅麻生長受抑制；0,5-二磷酸核酮糖羧化酶和與光和作用相關(guān)的蛋白上調(diào)加強了紅麻在逆境下的光呼吸來抵御鹽害；超氧化物歧化酶表達

6、量上調(diào),使紅麻清除細胞內(nèi)的自由基能力提高。差異蛋白參與代謝過程有些是一種普遍的脅迫反應(yīng),來幫助紅麻在逆境條件下生存,也有些代謝過程會有助于減少鹽脅迫產(chǎn)生的負面的生理影響。紅麻可以在鹽脅迫下,經(jīng)過多種途徑來調(diào)節(jié)鹽脅迫反應(yīng)蛋白,從而影響代謝模式、細胞功能、細胞防御以維持相對的離子平衡和生長。
　　 最后,進一步分析了不同鹽脅迫條件下紅麻葉片的抗氧化酶活性的變化。將紅麻幼苗在0、140 mM NaCl的半強度Hoagland營養(yǎng)液下分

7、別處理3、6、9 d和在0、70、140、200 mM NaCl的半強度Hoagland營養(yǎng)液下處理6 d,分別測定植株鮮重、根長、莖長、葉片H2O2、丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽還原酶(GR)活性。實驗表明,鹽脅迫下,紅麻幼苗生長的受抑制程度基本上隨脅迫時間和鹽濃度的增加而加重。葉片中MDA和H2O2的含量也隨脅迫時間和鹽濃度的增加而增加。SOD活性,在鹽脅迫下波