孵化后期外源二糖和谷氨酰胺調(diào)控肉鴨骨骼肌蛋白質(zhì)代謝機(jī)制研究.pdf

1、為滿足小腸快速發(fā)育和機(jī)體頻繁活動(dòng)所需要的大量能量,孵化后期的家禽胚胎常常發(fā)生骨骼肌的大量降解,動(dòng)員蛋白質(zhì)產(chǎn)生的氨基酸來(lái)提供糖異生所需的底物和腸道發(fā)育需要的特異氨基酸。骨骼肌降解的結(jié)果可能導(dǎo)致出殼后骨骼肌生長(zhǎng)的延緩。本研究以肉鴨胚胎為材料,研究孵化后期機(jī)體能量代謝和骨骼肌蛋白質(zhì)代謝變化規(guī)律,來(lái)探討孵化后期機(jī)體的能量狀態(tài)和骨骼肌發(fā)育的關(guān)系:并運(yùn)用胚蛋注射技術(shù),為孵化后期肉鴨胚胎補(bǔ)充二糖、谷氨酰胺和β-羥-β-甲基丁酸,探討家禽孵化后期營(yíng)養(yǎng)干

2、預(yù)對(duì)小腸發(fā)育及骨骼肌生長(zhǎng)的調(diào)控作用及機(jī)制。本研究由4部分組成。
　　 第一部研究孵化后期及出殼早期肉鴨能量狀態(tài)、小腸發(fā)育及胸肌中蛋白質(zhì)合成與降解變化,以探討孵化后期機(jī)體能量狀態(tài)、小腸發(fā)育與骨骼肌生長(zhǎng)的關(guān)系。在孵化期22d(22E)、25d(25E)、出殼當(dāng)天(0d)、出殼后3d(3d)、7d(7d),分別采集胸肌、肝臟、血樣(n=10)和空腸(n=8)。分析空腸蔗糖酶和麥芽糖酶活性,對(duì)空腸作石蠟切片并度量腸絨毛高度；用碘顯色法分

3、析肝臟和胸肌中糖原濃度:對(duì)胸肌作石蠟切片并度量肌纖維束和肌纖維橫截面積；用熒光定量PCR法檢測(cè)胸肌中Atrogin-1和FoxO1基因mRNA表達(dá)豐度；采用Western Blot技術(shù)分析胸肌中p-AMPK(Thr172)、p-FoxO1(Ser256)和p-S6K1(Thr389)蛋白表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn):肝糖原和肌糖原濃度從22E到0d分別下降了58％和85％(P<0.05),出殼后肝糖原濃度隨時(shí)間而增加(P<0.05)。血糖濃度從孵化期

4、22d到出殼當(dāng)天上升了135％(P<0.05),出殼后隨同齡而繼續(xù)上升(P<0.0001)。小腸重量和長(zhǎng)度從孵化期22d到出殼當(dāng)天分別上升352％(P<0.0001)和48％(P<0.05)；出殼后7d,小腸重量和長(zhǎng)度分別比出殼當(dāng)天提高了500％和107％(P<0.01)。相似地,空腸絨毛高度和麥芽糖酶活性從孵化期22d到出殼當(dāng)天分別增加了1.5倍和12倍(P<0.05)；出殼后,空腸絨毛高度、蔗糖酶和麥芽糖酶活性隨日齡顯著上升(P<0

5、.05)。胸肌重量從孵化期22d到出殼當(dāng)天下降了45％(P<0.0001),出殼后隨同齡而顯著增加(P<0.01)。胸肌的肌纖維束和肌纖維橫截面積從孵化期22d到出殼當(dāng)天分別顯著下降了54％和50％(P<0.05)；出殼后肌纖維束和肌纖維橫截面積隨同齡而提高(P<0.05)。胸肌中Atrogin-1 mRNA表達(dá)豐度從孵化期22d到出殼當(dāng)天上調(diào)了74倍(P<0.0001)；出殼后7d,Atrogin-1mRNA表達(dá)豐度下降到孵化期22d

6、的水平。出殼當(dāng)天,胸肌中FoxO1 mRNA表達(dá)豐度于比孵化期22d上調(diào)了5倍(P<0.0001),而到7d時(shí)受到顯著下調(diào)(P<0.05)。從孵化期22d到出殼當(dāng)天,胸肌中p-AMPK/AMPK下降了77.5％(P<0.01)；出殼后7d仍維持在較低水平。孵化期25d,胸肌中p-FoxO1/FoxO1于各階段最低,而出殼后7d顯著高于孵化期25d水平(P<0.05)。從孵化期22d到出殼當(dāng)天,胸肌中p-S6K1/S6K1下降了71.4％

7、(P<0.05)；出殼后7d,p-S6K1/S6K1顯著上升(P<0.05)。本試驗(yàn)結(jié)果表明:肉鴨孵化后期小腸發(fā)育和能量動(dòng)員加快；泛素系統(tǒng)所參與的骨骼肌蛋白質(zhì)分解代謝增強(qiáng)；蛋白質(zhì)合成受到抑制,從而導(dǎo)致了骨骼肌的負(fù)生長(zhǎng)。
　　 第二部分研究孵化后期補(bǔ)充二糖和丙氨酰-谷氨酰胺對(duì)肉鴨胚胎機(jī)體能量貯存的影響。本試驗(yàn)選擇發(fā)育良好的胚蛋520枚,隨機(jī)分為4組。在孵化期23d(23E),對(duì)3個(gè)試驗(yàn)組分別胚蛋注射以下?tīng)I(yíng)養(yǎng)物質(zhì):1)蔗糖+麥芽糖(

8、DS)；2)丙氨酰-谷氨酰胺(Ala-Gln)；3)蔗糖+麥芽糖+丙氨酰.谷氨酰胺(DS+Ala-Gln),以不注射任何物質(zhì)的空白組為對(duì)照。出殼后各處理分為10個(gè)重復(fù),單欄飼養(yǎng),提供相同的商業(yè)飼料。于孵化期25d(25E)、出殼當(dāng)天(0d)、出殼后3d(3d)、7d(7d),各處理中取10只肉鴨稱量體重后屠宰,分別采集胸肌、肝臟和血樣(n=10)。檢測(cè)肝臟和胸肌中糖原濃度、肝臟中葡萄糖-6-磷酸酶活性及血糖濃度。結(jié)果發(fā)現(xiàn):孵化期25d,

9、胚蛋注射DS和DS+Ala-Gln比對(duì)照組顯著提高了肝糖原濃度(P<0.05)；出殼后3d,對(duì)照組和DS組肝糖原濃度顯著高于Ala-Gln和DS+Ala-Gln組(P<0.05)。孵化期25d,Ala-Gln和DS+Ala-Gln組的肌糖原濃度顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。DS和Ala-Gln組血糖濃度于出殼當(dāng)天和出殼后3d顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。孵化期25d,胚蛋注射DS、Ala-Gln和DS+Ala-Gln組肝臟中的葡萄糖

10、-6-磷酸酶活性顯著低于對(duì)照組(P<0.05):而出殼后7d,DS和DS+Ala-Gln組中葡萄糖-6-磷酸酶活性顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。相關(guān)分析表明,肉鴨肝糖原濃度與體重呈高度的正相關(guān)(r=0.809,P<0.0001)。本試驗(yàn)結(jié)果表明:孵化后期DS和Ala-Gln的補(bǔ)充能夠增加肉鴨胚胎肝臟和胸肌中糖原貯備,而補(bǔ)充Ala-Gin和。DS+Ala-Gln降低了出殼后早期肝臟中糖原貯存。
　　 第三部分研究了孵化后期補(bǔ)充能

11、量底物和腸道調(diào)節(jié)物對(duì)肉鴨胚胎及出殼后早期小腸發(fā)育的影響。選擇發(fā)育良好的胚蛋520枚平均分為4組。在孵化期23d(23E)對(duì)3個(gè)試驗(yàn)組分別注射:1)二糖(蔗糖+麥芽糖)(DS)；2)二糖+谷氨酰胺(DS+Gln)；3)二糖+β-羥-β-甲基丁酸(DS+HMB),以不注射任何物質(zhì)的空白組為對(duì)照。出殼后各處理分為8個(gè)重復(fù),試驗(yàn)各階段以重復(fù)欄為單位,度量每周體重(共5周)。采取孵化期25d(25E)、出殼當(dāng)天(0d)、出殼后3d(3d)和7d(

12、7d)各處理空腸樣品(n=8)。對(duì)空腸組織作石蠟切片和HE染色并進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析,測(cè)定空腸蔗糖酶、麥芽糖酶活性、DNA濃度和蛋白濃度。結(jié)果表明:相比對(duì)照組,孵化后期注射DS+HMB顯著提高了肉鴨出殼重(平均提高1g)(P<0.05)。4-7d階段,DS+Gln組同增重顯著高于對(duì)照組和DS組(P<0.05),而DS組日增重顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；出殼后7d,DS+Gln組體重比對(duì)照組DS分別高8％和9％(P<0.05)。DS+HMB

13、和DS+Gln組料肉比在4-7d階段顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。與對(duì)照組相比,胚蛋注射DS顯著降低了出殼當(dāng)天的小腸相對(duì)重和出殼后3d的小腸長(zhǎng)度(P<0.05),而提高了3d的空腸絨毛寬度和7d的腸絨毛表面積(P<0.05)。在孵化期25d和出殼后3d,DS+Gln組肌層厚度比對(duì)照組分別高29％和48％(P<0.05)。DS組空腸蔗糖酶活性在孵化期25d、出殼當(dāng)天、出殼后7d顯著高于對(duì)照組(P<0.05):DS+Gln和DS+HMB組

14、蔗糖酶活性分別于出殼當(dāng)天和出殼后7d顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。本試驗(yàn)結(jié)果表明:孵化后期補(bǔ)充DS+Gln改善了出殼后肉鴨早期生長(zhǎng)和小腸發(fā)育；而DS的補(bǔ)充不利于早期小腸發(fā)育和體增長(zhǎng)；DS+HMB的補(bǔ)充表現(xiàn)出對(duì)肉鴨小腸發(fā)育和體增長(zhǎng)表現(xiàn)出有限的改善效應(yīng)。
　　 第四部分探討孵化后期補(bǔ)充二糖(DS)和丙氨酰-谷氨酰胺(Ala-Gln)對(duì)肉鴨骨骼肌蛋白質(zhì)合成與分解代謝的影響。本試驗(yàn)胚蛋注射同第二部分。于孵化期25d(25E)、出殼當(dāng)天

15、(0d)、出殼后3d(3d)和7d(7d),分別采集胸肌樣品(n=10)。對(duì)胸肌作石蠟切片并度量肌纖維束和肌纖維橫截面積,采用熒光定量PCR方法檢測(cè)各組胸肌中Atrogin-1和FoxO1 mRNA表達(dá)豐度,用Western Blot分析各組胸肌中AMPK、FoxO1、S6K1蛋白以及相應(yīng)磷酸化蛋白的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn):盡管各處理組間的肌纖維橫截面積差異不顯著(P>0.05),但補(bǔ)充Ala-Gin顯著提高了孵化期25d、出殼當(dāng)天和出殼后3d

16、的肌纖維束橫截面積(P<0.05),而DS的補(bǔ)充僅提高了出殼后3d的肌纖維束橫截面積(P<0.05)。孵化期25d,補(bǔ)充DS和Ala-Gln組胸肌中Atrogin-1 mRNA表達(dá)豐度顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；各試驗(yàn)組Atrogin-1 mRNA表達(dá)豐度出殼后3d均顯著低于對(duì)照組(P<0.05),而7d卻顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。各試驗(yàn)組胸肌中FoxO1 mRNA表達(dá)豐度出殼后3d顯著高于對(duì)照組(P<0.05),而7d顯著低

17、于對(duì)照組(P<0.05)。孵化期25d,與對(duì)照組相比,補(bǔ)充DS顯著降低了胸肌中p-AMPK的表達(dá)(P<0.05),而補(bǔ)充Ala-Gln則顯著提高了p-AMPK和p-FoxO1的相對(duì)表達(dá)量(P<0.05)；同時(shí),在孵化期25d和出殼后3d,Ala-Gln組p-S6K1蛋白表達(dá)顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。本試驗(yàn)結(jié)果表明:孵化后期補(bǔ)充DS和Ala-Gln,緩解了家禽胚胎和出殼早期骨骼肌中泛素參與的骨骼肌蛋白質(zhì)降解,而Ala-Gln補(bǔ)充同時(shí)

18、還提高了骨骼肌蛋白質(zhì)的合成,促進(jìn)了骨骼肌的早期生長(zhǎng),但其效應(yīng)僅持續(xù)在出殼后較早階段。
　　 綜合以上試驗(yàn)結(jié)果,本研究得出以下結(jié)論:孵化后期肉鴨胚胎肝臟和骨骼肌中糖原大量動(dòng)員,小腸發(fā)育加快,機(jī)體處于能量緊缺狀態(tài)。此時(shí),骨骼肌中泛素-蛋白酶體參與的蛋白質(zhì)降解途徑增強(qiáng),骨骼肌分解代謝加快,而蛋白質(zhì)合成代謝受到抑制,骨骼肌呈現(xiàn)負(fù)增長(zhǎng)。孵化后期補(bǔ)充二糖和谷氨酰胺的混合物可以調(diào)控肉鴨小腸早期發(fā)育和機(jī)體生長(zhǎng)。二糖或丙氨酰胺.谷氨酰胺的補(bǔ)充能改