水稻黃單胞菌感知的水稻信號(hào)分子的分離及hcm1轉(zhuǎn)基因煙草的研究.pdf

1、水稻白葉枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)和水稻條斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola,Xooc)是水稻黃單胞菌(Xanthomonas oryzae,Xo)種下的兩個(gè)致病變種,分別引起的水稻白葉枯病(bacterial blight,BB)和水稻細(xì)菌性條斑病(bacterial leaf streak,BLS)在生產(chǎn)上造成較大危害。Xoo和Xooc均擁有決定在非

2、寄主植物上激發(fā)過敏反應(yīng)和在寄主植物上產(chǎn)生致病性的hrp(hypersensitiveresponse on nonhost plants and pathogenicity on host plants)基因簇。 通過改良Xcv(Xanthomonas campestris pv.vesicatoria)hrp基因的誘導(dǎo)培養(yǎng)基XVM2,本實(shí)驗(yàn)室獲得了適合Xoo與Xooc hrp基因誘導(dǎo)表達(dá)的基本培養(yǎng)基XOM3。用N6液體培養(yǎng)基振

3、蕩培養(yǎng),本研究有效建立起水稻的懸浮細(xì)胞系。為研究hrp基因的功能,本研究將Xooc的hrpX和hpa1基因啟動(dòng)子與綠色熒光蛋白基因gfp(green fluorescenceprotein)構(gòu)建為融合基因。熒光顯微檢測表明,Xo的hrp基因在營養(yǎng)豐富的NB培養(yǎng)基上不能有效表達(dá),在hrp誘導(dǎo)培養(yǎng)基XOM3上可有效表達(dá)；與水稻懸浮細(xì)胞,水稻愈傷細(xì)胞互作,Xo的hrp基因被高效誘導(dǎo)表達(dá)。這些結(jié)果表明,Xo的hrp基因是誘導(dǎo)表達(dá)的,本研究已成功

4、建立起Xo的hrp基因誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)。Xo hrp誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的建立為研究hrp基因的功能,發(fā)掘T3SS(type III secretion system)效應(yīng)分子以及開展Xoo和Xooc致病性比較遺傳學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。 為研究不同遺傳背景下Xooc hpa1和hrpX基因的表達(dá)情況,本研究將hrpX∷gfp、hpa1∷gfp融合基因?qū)隭ooc的hrpX、hpa1、hrpF,hrcV突變體中。綠色熒光蛋白表達(dá)揭示,在誘導(dǎo)表達(dá)條

5、件下,hpa1、hrpF、hrcV基因突變體中hpa1和hrpX基因的表達(dá)水平與野生型相當(dāng),表明hpa1、hrpF、hrcV基因突變不影響hpa1和hrpX基因的表達(dá)；而在誘導(dǎo)表達(dá)條件下hrpX突變體中,hpa1基因不能被誘導(dǎo)表達(dá),hrpX基因仍能維持野生型背景下的表達(dá)水平,表明hpa1基因的表達(dá)受HrpX蛋白的調(diào)控,hrpX基因的表達(dá)不受自身的調(diào)控,在hrpX基因的上游還存在別的調(diào)控因子。 為研究Xooc的Harpin和Avr

6、蛋白的泌出特性,本研究構(gòu)建了harpin∷gfp、avr/pth13∷gfp的融合蛋白基因,使其在誘導(dǎo)條件下表達(dá)。熒光顯微檢測結(jié)果表明,與水稻細(xì)胞共培養(yǎng)16h導(dǎo)入融合蛋白基因的RS105菌株在誘導(dǎo)條件下菌體不發(fā)熒光,且也沒有觀察到水稻細(xì)胞部位有熒光；導(dǎo)入融合蛋白基因的RS105菌株hrcV基因突變體在誘導(dǎo)條件下菌體可見熒光,與水稻懸浮細(xì)胞互作也未見水稻細(xì)胞部位有熒光,揭示Harpin∷GFP、Avr/pth13∷GFP融合蛋白通過T3S

7、S才能泌出至水稻細(xì)胞中。由于GFP的瞬時(shí)表達(dá)特性,在熒光激發(fā)光下難以觀察到水稻細(xì)胞部位有融合蛋白結(jié)合。以Xooc的RS105/pXG為供試菌株,本研究試圖從水稻懸浮細(xì)胞中分離能誘導(dǎo)hrp基因表達(dá)的水稻信號(hào)分子。RS105/pXG與水稻懸浮細(xì)胞互作16h,在懸浮培養(yǎng)液中游離的菌體hrp基因也能被誘導(dǎo)表達(dá)。根據(jù)這一結(jié)果,本研究在RS105與水稻懸浮細(xì)胞互作16h后的共培養(yǎng)液的基礎(chǔ)上獲得了RCM2,熒光檢測發(fā)現(xiàn)RCM2能誘導(dǎo)hrpX基因的表達(dá)

8、,表明其中含有能誘導(dǎo)hrp基因表達(dá)的信號(hào)分子。通過超濾離心,發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)信號(hào)分子存在于分子量小于5000D的溶液中。紫外-可見光(190nm-780nm)掃描結(jié)果表明,RCM2最大吸收峰在190-238nm處,在360-780nm處基本沒有吸收。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn),誘導(dǎo)信號(hào)分子是親水性的物質(zhì),不能被乙酸乙酯、氯仿、等萃取,也不能被80％甲醇、乙醇沉淀,對(duì)蛋白酶K不敏感,100℃20min信號(hào)分子不會(huì)失活。薄層層析結(jié)果揭示,RCM1與RCM2中

9、主要物質(zhì)成分均為為糖類,兩者比較主要是所含糖類的種類和含量不同。 HarpinXooc蛋白可在植物上激發(fā)HR(hypersensitive response)與誘導(dǎo)產(chǎn)生多種有益表型,如抗病、抗蟲、抗旱以及促進(jìn)植物生長等,但它沒有直接的殺菌活性。將HarpinXooc和Cecropin以及Melittin的活性結(jié)構(gòu)域通過polylinker與自由環(huán)進(jìn)行分子組合,重組表達(dá)后的Hcml(Hpal-Cecropin-Melittin)融

10、合蛋白在植物上可激發(fā)過敏反應(yīng)和誘導(dǎo)產(chǎn)生SAR(system acquired resistance),對(duì)革蘭氏陰性植物病原細(xì)菌和植物病原真菌具有殺菌功能。為研究Hcm1蛋白在植物體內(nèi)表達(dá)后是否也能賦予植物產(chǎn)生SAR,本研究通過土壤桿菌介導(dǎo)法將含hcm1基因的pBI121重組載體導(dǎo)入基因工程模式植物煙草中。在含Km(100mg/L)的MS固體培養(yǎng)基上篩選到具有抗性的煙草轉(zhuǎn)化植株,初步認(rèn)為是轉(zhuǎn)化成功的植株。PCR和Southern雜交證明融

11、合基因已經(jīng)整合到植物染色體上,RT-PCR結(jié)果證明轉(zhuǎn)化成功的植株中hcm1基因能夠正常轉(zhuǎn)錄表達(dá)。 Hcm1融合蛋白含有Hpa1蛋白完整的功能域,能在植物上激發(fā)HR反應(yīng)和誘導(dǎo)植物產(chǎn)生SAR,本研究通過RT-PCR檢測植物防衛(wèi)反應(yīng)途徑與HR反應(yīng)標(biāo)志基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況。結(jié)果表明,Hcm1融合蛋白在煙草中表達(dá)后,HR反應(yīng)標(biāo)志基因hin1與hsr203j的轉(zhuǎn)錄被激活,植物防衛(wèi)反應(yīng)途徑下游PR1α基因的表達(dá)也被激活,而相應(yīng)轉(zhuǎn)空載體的植株檢測