大花紅景天酪氧酸脫羧酶基因的克隆與功能分析.pdf

1、紅景天苷是從紅景天(Rhodiola rosea L.)中提取的一種糖苷(又稱配糖體或甙)，是由尿苷二磷酸葡萄糖的半縮醛羥基與另一非糖物質(zhì)酪醇中的羥基以縮醛鍵(甙鍵)脫水縮合而成的環(huán)狀縮醛衍生物。水解后能生成糖與非糖化合物，非糖部分稱為甙元(Aglycone)，酪醇屬于酚類化合物。紅景天苷具有抗衰老、增強(qiáng)免疫力、保護(hù)心血管、抗疲勞、抗輻射、抗腫瘤等作用。但天然藥源植物紅景天中紅景天苷含量較低(0.5％～4.1％，DW)，大大限制了商業(yè)化

2、的生產(chǎn)，紅景天苷的產(chǎn)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足市場的需求。化學(xué)合成紅景天苷成本高、回收率低，且國內(nèi)外報道的化學(xué)合成紅景天苷的方法相對來說沒有從天然紅景天植物中提取的多。近年來，隨著紅景天生物合成途徑相關(guān)酶基因的克隆，基因工程方法成為提高紅景天苷含量的有效途徑之一。本研究在前人研究的基礎(chǔ)上，采用RACE技術(shù)，以西藏大花紅景天為研究材料，克隆獲得了紅景天苷生物合成途徑中的關(guān)鍵酶酪氨酸脫羧酶基因(TYDC)，并對其做了相應(yīng)的生物信息學(xué)分析和功能驗證。

3、r>　　 TYDC催化酪氨酸轉(zhuǎn)化生成酪胺(對羥基苯乙胺)，是紅景天苷生物合成途徑中必需的一個酶。本研究基于RACE技術(shù)的同源性克隆方法，獲得了RcTYDC基因全長cDNA，為1657bp，RcTYDC編碼區(qū)長為1473 bp，編碼長490個氨基酸的蛋白質(zhì)，還包含一段長為79 bp的5’-UTR和105bp的3’-UTR，polyA長度為13bp，預(yù)測分子量大小為54.6kDa，預(yù)測等電點(diǎn)為5.55。
　　 對RcIYDC編碼的

4、氨基酸序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果表明RcTYDC與來源于其他植物的TYDC同源性高達(dá)45％～51％，且具有典型的TYDC催化活性域。在分子發(fā)育進(jìn)化樹上，RcTYDC與來源于植物、藻類、細(xì)菌、古細(xì)菌的TYDCs在發(fā)育進(jìn)化樹上聚為4支，RcTYDC與來源于植物玉米、水稻的TYDC親緣關(guān)系較接近，同屬于植物這一分支?？缒^(qū)分析表明，RcTYDC整個氨基酸序列均不存在跨膜區(qū)，說明其是一個胞質(zhì)蛋白。對RcTYDC的三級結(jié)構(gòu)模型預(yù)測表明，RcTY

5、DC與來源于野豬的TYDC的晶體模型具有高度的相似性，且具有典型的TYDC催化活性位點(diǎn)。對RcTYDC基因進(jìn)行功能驗證，結(jié)果表明將攜帶RcTYDC編碼區(qū)的質(zhì)粒pET28-RcTYDC轉(zhuǎn)入大腸桿菌Rosetta進(jìn)行原核表達(dá)之后，能使Rosetta菌株合成大小約53 kDa的重組RcTYDC蛋白。利用尿素對該蛋白進(jìn)行提取并透析復(fù)性后，以L-酪氨酸為反應(yīng)底物，在輔酶磷酸吡哆醛的存在下，檢測RcTYDC重組蛋白的催化活性，并用HPLC檢測到反應(yīng)

6、產(chǎn)物酪胺的生成表明本研究中克隆獲得的重組的RcTYDC蛋白具有TYDC酶的活性和功能。
　　 本研究還成功建立了大花紅景天的無菌苗培養(yǎng)體系，構(gòu)建了RcTYDC基因的植物高效表達(dá)載體。本研究的相關(guān)工作為紅景天苷生物合成的代謝調(diào)控奠定了基礎(chǔ)，為今后在中草藥中開展代謝途徑工程提供了啟發(fā)意義和借鑒價值。隨著紅景天苷生物合成相關(guān)酶基因的陸續(xù)被克隆，以及紅景天苷生物合成途徑的進(jìn)一步認(rèn)識，利用代謝工程手段提高紅景天苷含量越來越成為可能實施的一