萊姆病兩種檢測(cè)方法的建立.pdf

1、萊姆病是一種自然疫源性人獸共患病,由伯氏疏螺旋體引起,通過傳介蜱叮咬人或動(dòng)物傳播。該病臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣,可引起人體多系統(tǒng)、多器官的損害,嚴(yán)重者終生致殘甚至死亡,除威脅人類健康外,還通過危害家畜健康對(duì)畜牧業(yè)的發(fā)展構(gòu)成了威脅,已成為全球公共衛(wèi)生問題,于1992年被世界衛(wèi)生組織列入重點(diǎn)防治研究對(duì)象。
　　 對(duì)萊姆病的研究,大多研究集中在人上,在動(dòng)物上的研究相對(duì)較少。由于蜱是伯氏疏螺旋體的傳播媒介,動(dòng)物是其貯存宿主,它們?cè)谌R姆病的傳播中

2、發(fā)揮著重要的作用。本研究建立了伯氏疏螺旋體血清學(xué)診斷方法ELISA和病原學(xué)檢測(cè)方法real-time PCR,并運(yùn)用這些方法對(duì)我國(guó)部分疫區(qū)進(jìn)行了流行病學(xué)的初步調(diào)查。
　　 以伯氏疏螺旋體SZ(B.garinii)、BO23(B.afzelii)和B31(B.burgdorferi seiisus stricto)菌株的外膜蛋白OspC基因?yàn)榘谢?通過PCR擴(kuò)增出目的片段,克隆到表達(dá)載體pGEX-4T-1構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒,表達(dá)的

3、蛋白用MagneGSTM Protein Purification System純化。純化的蛋白用三株菌株免疫羊制備的陽(yáng)性血清做。Western Blot(WB)檢測(cè),結(jié)果顯示這三個(gè)基因型菌株的重組OspC具有抗原性及交叉反應(yīng),表明該重組蛋白是建立檢測(cè)羊體內(nèi)伯氏疏螺旋體相應(yīng)抗體ELISA方法的理想抗原。
　　 本研究中,SZ菌株的OspC重組蛋白用來建立了ELISA。建立的ELISA方法通過檢測(cè)200份陽(yáng)性血清和214份陰性血清

4、,估算出了該方法的敏感性和特異性分別為87.5％和86.4％。該方法與呂氏泰勒蟲、尤氏泰勒蟲、巴貝斯蟲(臨潭、寧夏、新疆、河北、天竺)、羊無漿體和羊弓形蟲的羊的陽(yáng)性血清沒有交叉反應(yīng)。通過調(diào)查502份(2004年)和360份(2010年)采集自甘肅省甘南自治區(qū)的羊血樣品,檢測(cè)陽(yáng)性率分別為5.4％和9.4％。
　　 通過參考Genbank中發(fā)表的伯氏疏螺旋體16S rRNA基因序列,設(shè)計(jì)檢測(cè)伯氏疏螺旋體的通用引物和探針,建立了rea

5、l-time PCR。該方法可特異性的檢測(cè)出阿氏疏螺旋體(B.afzelii)、伽氏疏螺旋體(B.garinii)和狹義伯氏疏螺旋體(B.burgdorferi sensu stricto),而與泰勒蟲、巴貝斯蟲、無漿體、衣原體和支原體病原無交叉反應(yīng)。其敏感性為常規(guī)PCR的104倍,能從22.88 fg的基因組DNA中檢測(cè)到伯氏疏螺旋體核酸。通過檢測(cè)采集自黑龍江尚志市的369份蜱(革蜱屬)樣品,及采集自甘肅省甘南自治州的186份牦牛和1