抗口蹄疫病毒轉(zhuǎn)基因綿羊重構(gòu)胚胎的制備.pdf

1、浙江大學(xué)博士學(xué)位論文抗口蹄疫病毒轉(zhuǎn)基因綿羊重構(gòu)胚胎的制備姓名：吾熱力哈孜哈孜汗申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：動(dòng)物遺傳育種指導(dǎo)教師：徐寧迎201106浙江大學(xué)學(xué)位論文巢、瘤胃、氣管、小腸、肺等組織上也有不同程度的表達(dá)，提示唧基因主要分布于綿羊的泌乳、生殖、呼吸和消化等系統(tǒng)；本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)av基因在綿羊腎、舌皮、喉頭、上顎、鼻內(nèi)皮等所謂口蹄疫敏感組織內(nèi)的表達(dá)量也比較低，說明，這可能與綿羊?qū)MDV感染的低敏感性有關(guān)。同時(shí)也提示著，口蹄疫易感動(dòng)物不同感

2、染特性不僅與病毒受體類型有關(guān)，且很有可能與口蹄疫病毒受體組織分布特性相關(guān)。2口蹄疫病毒顆粒在受體的介導(dǎo)下才能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，它是決定口蹄疫病毒宿主特異性和組織特異性的主要因素之一。已有的研究表明，至少有4種整聯(lián)蛋白avl31、avl33、ave6、ave8能介導(dǎo)口蹄疫病毒的感染，其中吖是4種受體的共用亞基。JacksonTeta1(2002)研究發(fā)現(xiàn)，病毒的吸附可被抗0cv的單抗阻斷，但不能被抗0cvD5的單抗所阻斷，證實(shí)洲亞基是結(jié)合病毒的

3、主要部位。本研究以ITGAV為靶基因，設(shè)計(jì)合成了三條siRNA分子，并構(gòu)建相應(yīng)真核表達(dá)載體，經(jīng)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染BHK21細(xì)胞后通過雙熒光篩選發(fā)現(xiàn)，其中GenesilAVl能顯著抑制AV基因mRNA的表達(dá)。這些結(jié)果為利用該載體抑制ITGAV基因，獲得綿羊Av基因缺失模式細(xì)胞，為進(jìn)一步探討該基因的功能及121蹄疫病毒的有效防御提供了參考數(shù)據(jù)。3對(duì)7個(gè)血清型的FMDV(口蹄疫病毒)基因組序列進(jìn)行同源性比較后，根據(jù)口蹄疫病毒高度保守區(qū)的序列和siRNA

4、設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)了6條特異性雙鏈小干擾RNA分子，并構(gòu)建了相應(yīng)的重組質(zhì)粒GenesilVPll，GenesilVPl2，GenesilVPl3，Genesil—VPl0(陰性對(duì)照質(zhì)粒)和Genesil2B(為經(jīng)驗(yàn)證的優(yōu)秀siRNA分子)及Genesil2Bo(陰性對(duì)照)；經(jīng)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染BHK21細(xì)胞后通過雙熒光篩選發(fā)現(xiàn)，GenesilVPll，GenesilVPl2，GenesilVPl3均能不同程度地抑制VPl基因的表達(dá)，其中Genesil

5、—VPl2對(duì)目標(biāo)基因的抑制效率最高(約80％)。這些結(jié)果為利用該載體抑制口蹄疫病毒復(fù)制，獲得抗口蹄疫細(xì)胞模型的奠定了基礎(chǔ)。4本部分試驗(yàn)結(jié)合前一部分試驗(yàn)，利用PCR和重組載體構(gòu)建等試驗(yàn)技術(shù)構(gòu)建了靶向FMDV病毒和受體基因的雙向PGKne0210xSiRNA真核表達(dá)載體。進(jìn)一步將試驗(yàn)二和試驗(yàn)三中篩選出的優(yōu)秀SiRNA分子和雙向PGKne0210xSiRNA，分別轉(zhuǎn)染BHK21細(xì)胞后，接種口蹄疫病毒結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞與對(duì)照組相比，不僅出現(xiàn)細(xì)