水稻花藥發(fā)育控制基因OsADF的功能分析.pdf

1、水稻(Oryza sativa L.)是最重要的糧食作物之一。水稻雄性不育與雜種優(yōu)勢(shì)的廣泛應(yīng)用在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上發(fā)揮了舉足輕重的作用。水稻產(chǎn)量和品質(zhì)的形成與花器官發(fā)育直接相關(guān)，而花器官發(fā)育的分子遺傳機(jī)制是目前植物發(fā)育生物學(xué)的研究熱點(diǎn)之一。因此，闡明水稻花器官發(fā)育的分子遺傳機(jī)制具有重要意義。生殖發(fā)育過程中最重要的器官之一是花藥，在花藥發(fā)育過程中，絨氈層細(xì)胞經(jīng)歷一個(gè)細(xì)胞程序性死亡(Programmed Cell Death，PCD)的過程來促進(jìn)絨

2、氈層細(xì)胞的降解，以期為花粉外壁的形成以及花粉的發(fā)育提供必須的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。但絨氈層細(xì)胞在整個(gè)小孢子發(fā)育過程中如何逐漸消亡以及如何參與到小孢子發(fā)育的分子機(jī)制并不清楚。
　　 前期曾分離到一個(gè)隱性核基因控制的水稻雄性不育突變體tdr(tapetum degradation retardation)，組織切片、透射電鏡等分析結(jié)果表明該突變體花藥絨氈層降解延遲，小孢子發(fā)育異常，最終導(dǎo)致雄性不育。利用圖位克隆技術(shù)分離到TDR基因，TDR基因編

3、碼一個(gè)bHLH(basic Helix Loop Helix)轉(zhuǎn)錄因子的核蛋白，并通過調(diào)控下游基因在水稻花藥絨氈層降解和發(fā)育過程中發(fā)揮重要的作用。目前已利用染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)(ChIP)和ChIP-sequencing方法初步尋找到一批可能受到TDR調(diào)節(jié)的候選下游基因。其中OsADF基因(LOC_Os10g03660)是F-box蛋白家族成員。F-box蛋白是一類含有F-box結(jié)構(gòu)域，在泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)水解過程中具有底物識(shí)別特性的蛋白質(zhì)

4、家族。這類蛋白質(zhì)在細(xì)胞循環(huán)、信號(hào)傳導(dǎo)、基因轉(zhuǎn)錄、雄性不育和細(xì)胞程序性死亡等多種生理過程中發(fā)揮重要作用。本研究利用定量ChIP-PCR技術(shù)等分析方法對(duì)OsADF基因進(jìn)行分離篩選驗(yàn)證并對(duì)其功能及表達(dá)模式進(jìn)行深入研究，主要結(jié)果如下：
　　 1.定量ChIP-PCR、凝膠遷移率實(shí)驗(yàn)(EMSA)結(jié)果驗(yàn)證了OsADF基因受TDR直接調(diào)控。另外，OsADF本身在tdr突變體中沒有表達(dá)，利用TDR的啟動(dòng)子在tdr突變體中表達(dá)OsADF，結(jié)果顯示

5、，TDR啟動(dòng)子可以啟動(dòng)OsADF基因的表達(dá)，此結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證TDR對(duì)OsADF基因的調(diào)控作用。
　　 2.生物信息分析結(jié)果表明OsADF基因是F-Box蛋白家族。在日本晴中過量表達(dá)OsADF基因，獲得的陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株出現(xiàn)育性下降的表型。通過RNAi干擾技術(shù)降低OsADF基因在水稻中的表達(dá)水平，可以檢測(cè)到轉(zhuǎn)基因植株不同程度的出現(xiàn)不育的表型，并且通過半薄切片分析發(fā)現(xiàn)花粉發(fā)育的后期絨粘層細(xì)胞異常膨大，不能進(jìn)行正常的PCD降解，最終影響

6、花粉發(fā)育，從而導(dǎo)致雄性不育，其表型與tdr突變體的表型基本一致。RT-PCR以及qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明OsADF在干擾植株中表達(dá)量明顯下降，這一結(jié)果說明目的基因的正常表達(dá)對(duì)水稻花粉的形成起著非常重要的作用。
　　 3.RT-PCR、OsADF啟動(dòng)子與報(bào)告基因Gus融合表達(dá)以及原位雜交結(jié)果表明，從花藥發(fā)育第9期到第12期，OsADF基因在絨氈層和小孢子中特異表達(dá)。亞細(xì)胞定位研究表明OsADF蛋白定位在細(xì)胞膜上，該基因在細(xì)胞核中