水稻CCCH型鋅指核酸結(jié)合蛋白基因C3H12的分離克隆和功能鑒定.pdf

1、水稻是人類重要的糧食作物。白葉枯病是造成水稻減產(chǎn)的主要病害之一，每年都造成巨大的經(jīng)濟損失，研究和發(fā)掘水稻自身攜帶的抗病相關(guān)基因可為培育優(yōu)良的抗性品種提供新的路徑，同時也可推動水稻抗病機理研究的不斷發(fā)展。
　　 含有保守的三個半胱氨酸(Cysteine，Cys或C)和一個組氨酸(Histidine，His或H)結(jié)構(gòu)域的鋅指蛋白被稱為CCCH型鋅指蛋白。研究發(fā)現(xiàn)在水稻中這類蛋白是一個大的家族，含有至少67個成員，但是它們的功能卻鮮為

2、人知。本研究運用植物分子生物學(xué)和生物化學(xué)領(lǐng)域的前沿技術(shù)，揭示了水稻中一個含有5個典型的CX8-CX5-CX3-H(X代表任意氨基酸殘基)保守結(jié)構(gòu)域的CCCH型鋅指蛋白家族成員C3H12在抗白葉枯病反應(yīng)過程中發(fā)揮作用。
　　 利用數(shù)量性狀位點(quantitative trait locus，QTL)分析確證了C3H12與一個微效抗白葉枯病QTL相對應(yīng)，并且在定位群體中隨機挑選的單株里發(fā)現(xiàn)C3H12的表達量與植株抗病性的改變呈正相

3、關(guān)。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的的遺傳轉(zhuǎn)化在高感白葉枯的粳稻品種牡丹江8超量表達C3H12，在中感白葉枯的粳稻品種中花11中利用T-DNA插入和在中抗白葉枯的秈稻品種明恢63中利用RNA干擾技術(shù)(RNA interference，RNAi)抑制C3H12的表達。通過定量PCR檢測證明了在轉(zhuǎn)基因植株中抗性的改變與C3H12的表達量呈共分離的關(guān)系。C3H12超表達的植株對白葉枯病的抗性相對于野生型有著顯著的提高，并且在C3H12超表達的植株接種白葉枯病

4、菌后，茉莉酸路徑相關(guān)基因LOX.AOS2、Cht1、PR5和PR10的表達以及茉莉酸的含量與野生型對照相比均有顯著提高。與之相反，在C3H12抑制表達的植株對白葉枯病的抗性相對于野生型有著明顯的下降，并且在C3H12抑制表達的植株接種白葉枯病菌后，茉莉酸路徑相關(guān)基因的表達以及茉莉酸的含量與野生型對照相比均有顯著降低。據(jù)此我們推斷C3H12可能通過茉莉酸信號路徑正調(diào)控水稻對白葉枯病的抗性。
　　 通過亞細胞定位實驗發(fā)現(xiàn)C3H12蛋

5、白定位在細胞核里，而且在體外表達并純化了帶有麥芽糖結(jié)合蛋白(maltose binding protein，MBP)標簽的C3H12蛋白，體外核酸結(jié)合實驗發(fā)現(xiàn)C3H12具有核酸結(jié)合能力，而在酵母中的反式激活實驗里發(fā)現(xiàn)C3H12并沒有轉(zhuǎn)錄激活的活性。據(jù)此我們推斷，C3H12蛋白可能是通過與mRNA結(jié)合的方式在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達。
　　 綜上所述，C3H12作為一個具有核酸結(jié)合能力的蛋白，通過茉莉酸路徑正調(diào)控水稻對白葉枯病的抗