利用RNAi技術(shù)創(chuàng)建無(wú)標(biāo)記基因的抗病毒轉(zhuǎn)基因水稻.pdf

1、水稻是世界上最重要的糧食作物之一,占我國(guó)糧食生產(chǎn)和消費(fèi)的40％,在糧食安全和國(guó)民經(jīng)濟(jì)中占有舉足輕重的作用。由水稻條紋病毒(Rice stripe virus,RSV)引起的水稻條紋葉枯病是我國(guó)粳稻種植區(qū)最重要的水稻病毒病害。流行年份,一般田塊減產(chǎn)20％～30％,嚴(yán)重田塊達(dá)80％以上,甚至顆粒無(wú)收。近幾年,由水稻黑條矮縮病毒(Rice black streaked dwarf virus,RBSDV)引起的水稻黑條矮縮病再度爆發(fā)流行,一般

2、田塊發(fā)病株率10～30％,嚴(yán)重田塊可高達(dá)40～80％以上。在田間這兩種病毒病常?；旌习l(fā)生、危害巨大。對(duì)于病毒病而言,最為經(jīng)濟(jì)有效的防治途徑是利用品種自身的抗性達(dá)到主動(dòng)控治病害的目的,然而傳統(tǒng)的育種獲得兼抗兩種病毒病、高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)品種的難度極大。本研究采用轉(zhuǎn)基因技術(shù),首先構(gòu)建含兩種病毒保守序列的RNA干擾(RNAinterference,RNAi)載體,進(jìn)而利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化水稻成熟胚愈傷組織,通過(guò)組織培養(yǎng)獲得轉(zhuǎn)基因再生植株,并初步進(jìn)行了分

3、子檢測(cè)和抗病性鑒定,主要結(jié)果如下:
　　 1、分別克隆了RSV和RBSDV外殼蛋白(Coat protein,CP)基因的部分核苷酸片段(RSV—HCP、RBSDV—HS10),并獲得二者的串聯(lián)片段DR。利用RNA干涉載體pMCG161上的多克隆酶切位點(diǎn),分別將RSV—HCP、RBSDV—HS10和DR正向、負(fù)向插入,從而形成發(fā)夾結(jié)構(gòu),獲得的干涉載體分別命名為pMCG161+／-R、pMCG161+／-B和pMCG161+／-D

4、。由于上述干涉載體攜帶有氯霉素抗性基因,不適合農(nóng)桿菌介導(dǎo)法的遺傳轉(zhuǎn)化,因此再分別將上述3個(gè)干涉載體上的發(fā)夾結(jié)構(gòu)連接到適合農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化,且不含潮霉素(hpt)抗性基因的載體pCAMBIA1301-hpt-上,獲得了3個(gè)不含抗生素標(biāo)記基因的RNAi載體,分別命名為pCAMBIA1301+／-R、pCAMBIA1301+／-B和pCAMBIA1301+／-D。
　　 2、采用雙菌株、雙質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化的方法,將攜帶hpt抗性基因的pCA

5、MBIA1301質(zhì)粒和不攜帶hpt抗性基因的pCAMBIA1301+／-R、pCAMBIA1301+／-B和pCAMBIA1301+／-D質(zhì)粒分別電擊轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌超毒力菌株EHA105中,通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化將兩個(gè)獨(dú)立的分別攜帶目的基因和hpt抗性基因的T—DNA區(qū)共整合到水稻模式品種愛(ài)知旭的基因組中,目的是既可以在T0代通過(guò)抗生素進(jìn)行抗性愈傷的篩選,又可以通過(guò)轉(zhuǎn)基因再生植株后代分離,獲得不含標(biāo)記基因的抗病毒材料。
　　 3、在農(nóng)桿菌E

6、HA105的介導(dǎo)下,將上述載體分別導(dǎo)入水稻品種愛(ài)知旭的成熟胚愈傷組織中,經(jīng)潮霉素篩選,獲得轉(zhuǎn)雙價(jià)載體pCAMBIA1301+／-D的抗性愈傷組織514個(gè),分化得到447株再生植株；獲得轉(zhuǎn)單價(jià)載體pCAMBIA1301+／-R的抗性愈傷組織202個(gè),分化得到再生植株139株;轉(zhuǎn)單價(jià)載體pCAMBIA1301+／-B的抗性愈傷組織179個(gè),分化得到105株再生植株。
　　 4、對(duì)256株轉(zhuǎn)雙價(jià)載體pCAMBIA1301+／-D的T0

7、代植株進(jìn)行檢測(cè)時(shí),常規(guī)的PCR體系僅檢測(cè)到46株含目的基因的陽(yáng)性植株,共轉(zhuǎn)化率為16.8％,與大多數(shù)報(bào)道的雙菌雙質(zhì)粒介導(dǎo)的共轉(zhuǎn)化率相近。應(yīng)用本研究建立的巢式PCR體系,447株可檢測(cè)出陽(yáng)性植株148株,共轉(zhuǎn)化率上升到33.3％,說(shuō)明在雙菌雙質(zhì)粒介導(dǎo)的共轉(zhuǎn)化體系中共轉(zhuǎn)化率可能會(huì)因檢測(cè)體系靈敏度的提高而提高。
　　 5、將轉(zhuǎn)基因T0代幼苗移栽到RSV重發(fā)區(qū)河南鄭州,選擇田間自然發(fā)病嚴(yán)重的田快,通過(guò)自然發(fā)病進(jìn)行了抗病性評(píng)價(jià),移栽30～

8、35天后的調(diào)查結(jié)果表明:轉(zhuǎn)化載體pCMBIA1301+／-D的植株88棵中,其中8株未表現(xiàn)癥狀(0級(jí)),34株表現(xiàn)輕微癥狀(Ⅰ級(jí)),29株表現(xiàn)中等癥狀(Ⅱ級(jí)),10株嚴(yán)重癥狀(Ⅲ),7株極嚴(yán)重癥狀(Ⅳ)。但受體發(fā)病嚴(yán)重,全部為Ⅲ或Ⅳ級(jí),發(fā)病株率為100％,結(jié)果表明:盡管轉(zhuǎn)基因水稻不同株系間存在明顯的抗病性差異,但總體來(lái)看,轉(zhuǎn)基因水稻T0代植株的長(zhǎng)勢(shì)明顯優(yōu)于非轉(zhuǎn)基因受體植株,可以篩選到高抗RSV的株系。目前正在江蘇省建湖縣和姜堰縣分別對(duì)T