球孢白僵菌過氧化氫酶BbcatA的功能分析.pdf

1、作為經(jīng)典的絲狀昆蟲病原真菌，球孢白僵菌因易于生產(chǎn)和環(huán)境友好等優(yōu)點而在農(nóng)林害蟲防治中廣泛應用。昆蟲病原真菌抗逆的分子機理直接關系到生防菌劑的田間穩(wěn)定性和應用效果。作為細胞抗氧化酶系的主要成員之一，過氧化氫酶在細胞抵抗活性氧自由基(ROS)脅迫過程中發(fā)揮著重要的作用。然而，目前罕見關于球孢白僵菌過氧化氫酶基因及其功能的研究報道，其對生防真菌抗逆生性狀的貢獻知之甚少。為此，本論文試從以過氧化氫酶基因為切入點，利用同源重組的方法敲除球孢白僵菌過

2、氧化氫酶基因BbcatA，通過過氧化氫酶基因的缺失對菌株的抗逆力和毒力產(chǎn)生的影響，解析BbcatA的表達調(diào)控，為菌株改良提高提供了新的基因資源。主要研究內(nèi)容及結果如下：
　　 BbcatA基因的克隆與表達調(diào)控通過序列比對及簡并引物擴增，從球孢白僵菌Bb2860菌株基因組中克隆到單功能大亞基過氧化氫酶BbcatA基因，全長2235 bp，含1個60bp的內(nèi)含子。ORF全長2175bp，編碼724個氨基酸，編碼蛋白質(zhì)的分子量和等電點

3、分別為80.7kDa和6.8。該蛋白與其它絲狀真菌的孢子特異性過氧化氫酶具有較高的同源性，與番茄葉霉病菌catA的同源性最高。BbcatA蛋白結構具有其它真菌過氧化氫酶結構中典型的血紅素接合位點和氨基酸殘基保守序列。氨基酸序列比對分析顯示，BbcatA系CAT家族Ⅱ組的成員，屬于單功能過氧化氫酶。
　　 BbcatA在菌絲中轉錄表達的前兩天保持較高的水平，第3天急劇減少，在此后的4天里又逐步增強，但都達不到第二天的水平。在50m

4、M H202的刺激下，基因表達水平顯著變化，脅迫1小時后的基因表達水平為空白對照的2.5倍；隨著脅迫時間的的延長，BbCatA基因的表達水平進一步升高，脅迫3小時的表達水平為空白對照的4.5倍。結果表明，BbcatA參與H202氧化脅迫的防御。
　　 BbcatA基因敲除及突變株表型分析應用根癌農(nóng)桿菌介導的遺傳轉化方法成功構建BbcatA的缺失突變株△BbcatA。在萌發(fā)實驗中，△BbcatA的分生孢子對H202十分敏感，H20

5、2的半致死濃度LC50比野生株下降42.2％。在紫外輻射與熱脅迫實驗中，△BbcatA的分生孢子對UV-B輻射的耐受力比野生株降低51.7％，對45℃熱脅迫的半致死時間LT50比野生株降低37％。在生物測定中，△BbcatA分生孢子接種斜紋夜蛾二齡幼蟲的致死率為59.8％，而野生株分生孢子的致死率為86.9％;△BbcatA對斜紋夜蛾二齡幼蟲的LT50為6.4天，比野生株延長1.4天，表明BbcatA在較大程度上影響菌株的毒力。