中國番茄黃曲葉病毒衛(wèi)星編碼βC1蛋白的寄主互作因子鑒定.pdf

1、中國番茄黃曲葉病毒(Tomatoyellow leaf curl China virus，TYLCCNV)是一種伴隨有衛(wèi)星DNA的單組份雙生病毒，在自然界以TYLCCNV/TYLCCNVbetasatellite(TYLCCNB)病害復合體的形式侵染寄主。TYLCCNV/TYLCCNB能夠在番茄和煙草等多種植物上引起曲葉、黃化、葉脈增厚、耳突以及矮化等癥狀，而TYLCCNB互補鏈上編碼的βCl蛋白是癥狀決定因子。
　　 為了更好

2、地了解TYLCCNV/TYLCCNB病毒復合體在番茄上的致病機理以及番茄在抵御病毒入侵過程中產(chǎn)生的防衛(wèi)反應，本研究首先通過提取番茄總RNA并構建了番茄cDNA文庫。隨后以病毒致病因子βCl蛋白為誘餌在番茄cDNA文庫中篩選與βCl蛋白互作的寄主因子，獲得157個陽性酵母菌落，共包含了113條番茄寄主因子的cDNA信息，其中有48條為功能已知蛋白的cDNA序列。從釣取到的48種潛在互作因子中挑取了10種用于全長基因的克隆以及與βCl蛋白互

3、作的驗證，最終發(fā)現(xiàn)番茄的一種E3泛素連接酶RING finger蛋白SlRFP和一種絲/蘇氨酸蛋白激酶SlSnRK1能夠與βCl蛋白發(fā)生特異性相互作用。
　　 對TYLCCNBβCl與番茄RING finger蛋白SlRFP的互作機制進行了初步分析。通過酵母雙雜交以及雙分子熒光互補試驗證實βCl與全長SlRFP蛋白在體外和體內(nèi)條件下均能夠發(fā)生互作。隨后根據(jù)SlRFP的二級結(jié)構和保守功能區(qū)設計了5個突變體用于分析SlRFP中與βC

4、l蛋白互作的位點，結(jié)果表明SlRFP蛋白的RING tinger結(jié)構域(第448～481氨基酸)是βCl蛋白的主要結(jié)合位點。SlRFP基因在番茄的不同組織中均有表達但表達量存在差異，同時還發(fā)現(xiàn)SlRFP蛋白是一種核質(zhì)共定位蛋白。通過熒光定量PCR試驗證實TYLCCNV/TYLCCNB復合體的侵染能夠?qū)е路裇lRFP基因的表達量提高。
　　 為了進一步分析TYLCCNBβCl與SlSnRK1的互作機理，根據(jù)SlSnRK1和TYL

5、CCNBβCl的二級結(jié)構以及保守功能區(qū)分別設計了9個和8個突變體，用于分析二者互作所需的區(qū)域。酵母雙雜交結(jié)果顯示，TYLCCNBβCl與SlSnRK1的N端激酶結(jié)構域(第1～280氨基酸)并不存在明顯的互作，而與SlSnRK1 C端的泛素相關結(jié)構域(第281～339氨基酸)和自我抑制結(jié)構域(第340～449氨基酸)互作；對TYLCCNBβCl與SlSnRK1互作的結(jié)構域分析表明，βCl蛋白的完整結(jié)構是與SlSnRK1互作所必需的。