葡萄病毒A MP基因RNA干擾載體的構(gòu)建及其鑒定.pdf

1、RNA干擾(RNA interference,RNAi):當(dāng)一些小分子量的外源雙鏈RNA(dsRNA)進(jìn)入宿豐細(xì)胞后,特異地降解相應(yīng)序列的mRNA,從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默(PTGS)。RNA介導(dǎo)的抗病毒最有效的途徑是構(gòu)建病毒特定基因片段的反向重復(fù)序列載體,之后轉(zhuǎn)入植物中,轉(zhuǎn)錄后生成RNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)(hpRNA),發(fā)夾結(jié)構(gòu)的柄可誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后基因沉默,從而達(dá)到抗病毒的目的。
　　 利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)來研究植物基因功能

2、的報(bào)道很多,它不僅可以快速地導(dǎo)入外源基因,而且使轉(zhuǎn)入基因在短時(shí)間內(nèi)表達(dá),從而在功能基因組學(xué)上面發(fā)揮巨大的作用。
　　 葡萄病毒A(GVA)既是危害葡萄最為嚴(yán)重的病毒之一,分布廣泛,又是少數(shù)能摩擦接種到草木寄主的葡萄病毒之一,易于開展研究工作,可以帶動(dòng)其他病毒的相關(guān)理論問題和應(yīng)用實(shí)踐的研究。因此本文以GVA運(yùn)動(dòng)蛋白(MP)基因?yàn)槟０鍞U(kuò)增出了418bp的基因片段,根據(jù)RNA干擾的基本原理,構(gòu)建了RNA干擾載體,并成功轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌

3、中,通過瞬時(shí)表達(dá)來檢測(cè)干擾載體的抗性效果。主要的試驗(yàn)結(jié)果如下:
　　 1.基因片段的克隆與序列分析:設(shè)計(jì)引物克隆質(zhì)粒pDriver-MP中的一個(gè)基因片段,通過引物配以不同的酶切位點(diǎn),分別命名為:GVAF和GVAR,長度都為418bp,經(jīng)序列分析證明這兩個(gè)片段為目的基因片段,可用于構(gòu)建RNA干擾載體。
　　 2.RNA干擾載體的構(gòu)建:通過酶切、連接、PCR等方法將目的片段正反向分別插入到載體pFGC5941內(nèi)含子的兩側(cè),來

4、構(gòu)建干擾載體pFGC5941-GVAFR,經(jīng)菌液PCR和酶切鑒定證明干擾載體構(gòu)建成功。
　　 3.表達(dá)載體向農(nóng)桿菌中的轉(zhuǎn)化:通過凍融法將pFGC5941-GVAFR向農(nóng)桿菌中進(jìn)行轉(zhuǎn)化,菌液PCR檢測(cè)結(jié)果表明獲得了含有表達(dá)載體的農(nóng)桿菌EHA105。
　　 4.瞬時(shí)表達(dá)分析:向本氏煙中注射農(nóng)桿菌后接種GVA,通過表型觀察和PCR檢測(cè)得出:
　　 ①瞬時(shí)干擾作用具有時(shí)間依賴性:農(nóng)桿菌滲入3d,4d,5d后接種GVA對(duì)病